1、1专题七 选考 基因工程与克隆技术1(2018天津高考节选)甲型流感病毒为 RNA 病毒，易引起流感大规模流行。我国科学家在 2017 年发明了一种制备该病毒活疫苗的新方法，主要环节如下。(1)改造病毒的部分基因，使其失去在正常宿主细胞内的增殖能力。以病毒 RNA 为模板，逆转录成对应 DNA 后，利用_技术扩增，并将其中某些基因(不包括表面抗原基因)内个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码子的序列。与改造前的基因相比，改造后的基因表达时不能合成完整长度的_，因此不能产生子代病毒。将该改造基因、表面抗原等其他基因分别构建重组质粒，并保存。(2)构建适合改造病毒增殖的转基因宿主细胞。设计合成一种
2、特殊 tRNA 的基因，其产物的反密码子能与(1)中的终止密码子配对结合，并可携带一个非天然氨基酸(Uaa)。将该基因与_连接后导入宿主细胞。提取宿主细胞的_进行分子杂交鉴定，筛选获得成功表达上述 tRNA 的转基因宿主细胞。(3)利用转基因宿主细胞制备疫苗。将(1)中的重组质粒导入(2)中的转基因宿主细胞，并在补加_的培养基中进行培养，则该宿主细胞能利用上述特殊 tRNA，翻译出改造病毒基因的完整蛋白，产生大量子代病毒，用于制备疫苗。特殊 tRNA 基因转录时，识别其启动子的酶是_(单选)。A病毒的 DNA 聚合酶 B宿主的 DNA 聚合酶C病毒的 RNA 聚合酶 D宿主的 RNA 聚合酶解
3、析：(1)体外进行 DNA 扩增采用的技术手段是多聚酶链式反应(PCR 技术)。将基因内个别编码氨基酸的序列改造成编码终止密码子的序列后，在翻译时终止密码子提前出现，不能合成完整长度的多肽(或蛋白质)。(2)为了使目的基因能够在受体细胞中稳定存在并正常表达，需要将目的基因与载体连接后导入宿主细胞。利用分子杂交技术，鉴定筛选获得成功表达目的 RNA 的细胞时，需提取宿主细胞的总 RNA。(3)将(1)中的重组质粒导入(2)中的转基因宿主细胞，宿主细胞内由于没有 Uaa，翻译将会在终止密码子处停止，将不能翻译出改造病毒基因的完整蛋白，所以要想翻译出完整蛋白，需要在培养基中加入 Uaa。转录时，识别
4、启动子的酶为 RNA 聚合酶，因为转录在宿主细胞中进行，所以转录用的酶为宿主细胞的 RNA 聚合酶。答案：(1)PCR 多肽(或蛋白质) (2)载体 总 RNA (3)非天然氨基酸(Uaa) D 2如图表示科学家培育耐寒生物的过程，请回答下列问题：(1)从 cDNA 文库中获取的目的基因_(填“有”或“无”)启动子。实现过程常用_技术，该技术的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成_。2(2)表示_，其中标记基因的作用是_。(3)转基因技术是否成功，需要对受体细胞进行分子水平的检测，首先是用 DNA 分子杂交技术检测受体细胞染色体的 DNA 上是否插入目的基因，这种方法需要遵循_原则
5、。(4)若要培育抗冻能力强的转基因羊，可将鱼的抗冻蛋白基因导入羊的_中，培育该转基因羊的最后一道“工序”是胚胎工程的_技术。解析：(1)用某种生物发育的某个时期的 mRNA 反转录产生的多种互补的 DNA 片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群就叫这种生物的 cDNA 文库，cDNA 文库中没有基因的启动子，获得更多目的基因的方法是 PCR 技术。该技术的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物。(2)表示基因表达载体，其中标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因。(3)DNA 分子杂交技术遵循碱基互补配对原则。(4)目的基因导入受体细胞，若受体细胞为动物细
6、胞受精卵，则培育该动物的最后一道“工序”是胚胎移植。答案：(1)无 PCR 引物 (2)基因表达载体 鉴别受体细胞中是否含有目的基因 (3)碱基互补配对 (4)受精卵 胚胎移植3紫杉醇是最有效的抗癌制剂之一。生产紫杉醇的主要原料是天然生长的红豆杉树皮，而大量剥取树皮会造成树木死亡和资源破坏。请回答下列问题：(1)科研人员尝试从红豆杉的愈伤组织中提取紫杉醇，可采用_技术来获得红豆杉的愈伤组织。由红豆杉叶肉细胞得到愈伤组织的过程叫_。(2)在林业生产上，若连年种植红豆杉单一品种，往往会造成病虫害增加，这违反了生态工程的_原理。科研人员欲利用基因工程技术培育具有抗虫特性的红豆杉，该过程的核心步骤是_
7、。(3)科研人员尝试采用植物体细胞杂交技术培育能产生紫杉醇的速生“桉树红豆杉”杂种植株。在进行体细胞杂交之前，必须先利用_酶去除细胞壁，获得具有活力的原生质体。进行原生质体间的融合时，常使用的诱导剂是_。由杂种细胞发育成一个完整的杂种植株体现了植物细胞具有_的特点。解析：(1)通过植物组织培养技术可获得植物的愈伤组织。让已分化的细胞经过诱导后，失去其特有的结构和功能而转变成未分化细胞的过程称为脱分化。(2)连年种植单一品种造成病虫害增加，这违反了生态工程的物种多样性原理。基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建。(3)欲得到所需的原生质体，要利用纤维素酶和果胶酶去除正常植物细胞的细胞3壁。诱导原
8、生质体间的融合常使用的诱导剂是聚乙二醇(PEG)。由单个植物细胞得到完整生物体体现了植物细胞具有全能性的特点。答案：(1)植物组织培养 脱分化 (2)物种多样性 基因表达载体的构建 (3)纤维素酶和果胶 聚乙二醇(PEG) 全能性4(2018江苏扬州检测)嗜热菌可以生活在 98 的高温环境中，研究发现其耐热性与基因 H 的表达产物有关。如图表示某研究小组利用大肠杆菌对 H 基因实行的克隆和表达过程，其中 Nde 、 EcoR 、 Hind 、 Sal 四种限制酶的识别序列和酶切位点分别为 CA TATG、G AATTC、A AGCTT、G TCGAC。请分析回答：(1)图中的结构甲是_，其主要
9、作用是_。一个完整的基因表达载体组成，除了质粒 1 中所示结构外，还应该含有_。(2)用图中质粒 1 和 H 基因构建重组质粒，应选用_两种限制酶进行切割，影响限制酶处理效果的因素可能有_(多选)。反应温度 缓冲液 pH 限制酶的浓度 DNA 样品的纯度(3)实验中发现，重组质粒导入大肠杆菌后 H 基因的表达效率很低，但在含有质粒2(辅助性质粒)的细胞中，H 基因可以高效表达。为了筛选出转入了两种质粒的受体菌，应在筛选平板培养基中添加_，整个实验过程应保持_操作。(4)PCR 反应中引物的设计非常关键，据图分析，扩增 H 基因时应选择的一对引物是_。A引物：GGGAATTC；引物：CTCATA
10、TGB引物：GAATTCCC；引物：CATATGAGC引物：GGAAGCTT；引物：AAGCTTCCD引物：CTCATATG；引物：AAGCTTAAGCTT解析：(1)据图分析可知，甲是启动子，其作用是提供 RNA 聚合酶特异性识别结合位点，驱动基因转录。一个完整的基因表达载体包括启动子、终止子、目的基因、标记基因和复制原点等；质粒 1 中已经含有启动子和标记基因(抗生素 A 抗性基因)。(2)结合四种限制酶的识别序列和酶切位点，确定用图中质粒 1 和 H 基因构建重组质粒，应选用 Nde 、 EcoR 4 两种限制酶进行切割，影响酶的因素都影响限制酶的处理效果，所以可能有温度、pH、酶浓度和
11、底物的纯度，即。(3)对两种质粒的标记基因进行分析后可知，质粒 1 上含有抗生素 A 的抗性基因，质粒 2 上含有抗生素 B 的抗性基因，所以应在筛选平板培养基中添加抗生素 A 和抗生素 B。根据微生物的培养条件可知整个实验过程应保持无菌操作。(4)分析切割质粒和目的基因的两种限制酶 Nde 、 EcoR 的识别序列和切割位点，发现 A、B 选项的引物 中有 Nde 的识别序列 CA TATG；A、B 选项的引物 中都有EcoR 的识别序列 G AATTC，C、D 中都不含 Nde和 EcoR的识别序列和切割位点，所以选 A、B。答案：(1)启动子 提供 RNA 聚合酶特异性识别结合位点目的基
12、因、终止子(和复制原点) (2) Nde、 EcoR (3)抗生素 A 和抗生素 B 无菌 (4)AB5人的成纤维细胞与小鼠细胞进行融合获得部分杂种细胞，杂种细胞中人类染色体会随机丢失，各种杂种细胞保留人类染色体的种类和数量是不同的，由此可以分离得到许多种杂种细胞。请回答下列问题：(1)诱导动物细胞融合常用的诱导因素有_(至少写出两种)。细胞融合体现了细胞膜的_。(2)在培养容器中，诱导两类细胞两两融合，在加入诱导剂后，培养液中应该存在_种细胞。若只考虑人的成纤维细胞与鼠细胞两两融合形成的杂种细胞，假如每种杂种细胞只保留了人的 1 条染色体，从染色体组成的角度考虑，杂种细胞最多可能有_种。(3
13、)培养杂种细胞的过程中，细胞需置于含 CO2的混合气体的培养箱中培养，CO 2的主要作用是维持培养液的_。(4)动物细胞的培养相对植物细胞培养要困难得多，一般培养动物细胞时在培养基中必须要加入_，而培养植物细胞则不需要。(5)运用细胞融合技术还可以进行_的制备，请列举一项关于该物质的应用：_。解析：(1)动物细胞融合常用的诱导因素有聚乙二醇(PEG)、灭活的病毒、电激等。细胞融合体现了细胞膜的流动性。(2)培养液中存在人人融合细胞，人鼠融合细胞，鼠鼠融合细胞，以及没有融合的人成纤维细胞和小鼠细胞，共 5 种。人体细胞含有 23 对染色体，共有 24 种染色体(22 种常染色体XY)，所以当每种
14、杂种细胞只保留了人的 1 条染色体时，从染色体组成的角度考虑，杂种细胞最多可能有 24 种。(3)进行动物细胞培养时，需将其置于含 95%空气加 5% CO2的混合气体培养箱中， CO2的主要作用是维持培养液的5pH。(4)培养动物细胞时通常需要在培养基中加入血清、血浆等一些天然成分，而植物细胞培养则不需要。(5)运用细胞融合技术可以进行单克隆抗体的制备，单克隆抗体可以作为诊断试剂，也可以用于治疗疾病和运载药物。答案：(1)聚乙二醇(PEG)、灭活的病毒、电激(写出两种即可) 流动性 (2)5 24 (3)pH (4)血清、血浆 (5)单克隆抗体 作为诊断试剂(或用于治疗疾病和运载药物)6(2
15、019 届高三郴州模拟)女性怀孕后会分泌一种糖蛋白绒毛膜促性腺激素(HCG)，尿液中会检出 HCG 的存在。用抗 HCG 单克隆抗体制备的试纸可以测试女性是否怀孕。如图是抗 HCG 单克隆抗体制备流程示意图，请分析回答下列问题：(1)制备单克隆抗体利用的生物学技术有_和_。(2)促进动物细胞融合得到乙，常采用的方法有_。(3)用特定的选择培养基对乙筛选，得到的细胞丙的特点是_。(4)对丙检测筛选得到丁，采用的方法是_。生产的单克隆抗体可以与_特异性结合，从而诊断早孕。解析：(1)制备单克隆抗体的诱导过程有正常小鼠免疫处理、动物细胞的融合、杂交瘤细胞的筛选与培养、专一抗体检验阳性细胞培养、单克隆
16、抗体的提纯。要用到动物细胞培养和动物细胞融合技术。(2)促进动物细胞融合，常采用的方法有 PEG、电激、灭活的病毒等。(3)用特定的选择培养基对乙筛选，得到的细胞丙为杂交瘤细胞，其特点是既能无限增殖又能产生专一抗体。(4)对丙检测筛选得到丁(能产生特异性抗体的杂交瘤细胞)，所用方法为抗原抗体杂交，生产的单克隆抗体可以与人绒毛膜促性腺激素(或 HCG)特异性结合，从而诊断早孕。答案：(1)动物细胞培养 动物细胞融合 (2)PEG、电激、灭活的病毒 (3)既能无限增殖又能产生专一抗体 (4)抗原抗体杂交 人绒毛膜促性腺激素(或 HCG)7科学家将人的生长激素基因与 pBR322 质粒进行重组，将得
17、到的重组质粒导入牛的受精卵，再通过细胞工程培育为转基因克隆牛。pBR322 质粒含有 2 个抗生素抗性基因和 5个限制酶切点(如图 2)。请据图回答下列问题：6(1)图 1 中显示的人的生长激素基因是通过人工合成的，图中过程需要的酶是_。该过程所依据的碱基互补配对原则是_。(2)图 1 中的 mRNA 是从人体的_细胞中获取的。(3)重组质粒形成与否需要鉴定和筛选，方法是将重组质粒的 DNA 分子导入大肠杆菌，通过含抗生素的培养基进行培养，观察大肠杆菌的生长、繁殖情况进行判断。如图 3 所示：如果受体菌在培养基 A 上能生长、繁殖形成菌落，而不能在培养基 B 上生长、繁殖，则使用限制酶 a 的
18、切点是图 2 中的_，即目的基因插入了_中。如果受体菌在培养基 A 上不能生长、繁殖形成菌落，而在培养基 B 上能生长、繁殖，则使用限制酶 a 的切点是图 2 中的_，即目的基因插入了_中。如果受体菌在培养基 A 和培养基 B 上都能生长、繁殖形成菌落，则使用限制酶 a 的切点是图 2 中的_。解析：(1)根据图 1 分析，目的基因是通过 mRNA 逆转录形成的，需要逆转录酶的催化；RNA 中的碱基是 A、U、C、G，DNA 中的碱基是 A、T、C、G，所以配对方式是AT、UA、GC、CG。(2)根据题意，生长激素基因是目的基因，该基因表达产物由垂体细胞分泌，所以需要从垂体细胞中获取 mRNA
19、。(3)受体菌能在含氨苄青霉素的培养基上生存，不能在含四环素的培养基上生存，所以限制酶切点位于抗四环素基因内部，由图2 可知，是切点 3 或切点 4 或切点 5。受体菌不能在含氨苄青霉素的培养基上生存，能在含四环素的培养基上生存，所以限制酶切点位于抗氨苄青霉素基因内部，由图 2 可知，是切点 1。受体菌能在含氨苄青霉素的培养基上生存，也能在含四环素的培养基上生存，所以这两个抗生素抗性基因都没有被破坏，由图 2 可知，是切点 2。答案：(1)逆转录酶 AT、UA、GC、CG (2)垂体 (3)切点 3 或切点 4 或切点 5 抗四环素基因 切点 1 抗氨苄青霉素基因 切点 28图 1 为生产 H
20、IV 单克隆抗体的过程，图 2 为运用基因工程技术生产 HIV 疫苗的操作简要路径。据图分析回答：7(1)图 1 中，过程称为_技术。过程融合实验完成后，融合体系中通常会有_种细胞(只考虑一次融合)。杂交瘤细胞产生的抗体的优点是_。(2)图 2 中， 过程需要用到_酶。一个 DNA 片段进行扩增最简便的方法是使用 PCR 技术，如果这个过程中消耗了 62 个引物，则进行了_轮 DNA 复制。解析：(1)图 1 中，过程是人工诱导 HIV 自愈者免疫细胞与骨髓瘤细胞融合，称为(动物)细胞融合技术。过程融合实验完成后，融合体系中通常会有：没有融合的自愈者免疫细胞、没有融合的骨髓瘤细胞、自愈者免疫细
21、胞与自愈者免疫细胞融合的细胞、骨髓瘤细胞与骨髓瘤细胞融合的细胞、自愈者免疫细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交瘤细胞，即 5种细胞。杂交瘤细胞产生的抗体等同于单克隆抗体，其优点是特异性强、灵敏度高、并可大量制备。(2)图 2 中， 过程是以 RNA 为模板合成 DNA 的逆转录过程，需要用到逆转录酶。利用 PCR 技术扩增一个 DNA 片段的过程中，除了最初亲代 DNA 的两条模板链不含引物外，凡是新形成的子链均含有引物。如果利用 PCR 技术连续扩增 n 轮的过程中共消耗了引物 62 个，则 2n262，解得 n5。答案：(1)(动物)细胞融合 5 特异性强、灵敏度高、并可大量制备 (2)逆转录 59
22、(2018江苏高考)为生产具有特定性能的 淀粉酶，研究人员从某种海洋细菌中克隆了 淀粉酶基因(1 656 个碱基对)，利用基因工程大量制备 淀粉酶，实验流程见下图。请回答下列问题：(1)利用 PCR 技术扩增 淀粉酶基因前，需先获得细菌的_。(2)为了便于扩增的 DNA 片段与表达载体连接，需在引物的_端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是_8_。(3)进行扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，下列选项中_的设定与引物有关，_的设定与扩增片段的长度有关。(填序号)变性温度 退火温度 延伸温度 变性时间退火时间 延伸时间(4)如图表示筛选获得的工
23、程菌中编码 淀粉酶的 mRNA 的部分碱基序列：图中虚线框内 mRNA 片段包含_个密码子，如虚线框后的序列未知，预测虚线框后的第一个密码子最多有_种。(5)获得工程菌表达的 淀粉酶后，为探究影响酶活性的因素，以浓度为 1%的可溶性淀粉为底物测定酶活性，结果如下：缓冲液 50 mmol/L Na2HPO4KH2PO4 50 mmol/L TrisHCl 50 mmol/L GlyNaOHpH 6.0 6.5 7.0 7.5 7.5 8.0 8.5 9.0 9.0 9.5 10.0 10.5酶相对活性%25.4 40.2 49.8 63.2 70.1 95.5 99.5 85.3 68.1 63
24、.7 41.5 20.8根据上述实验结果，初步判断该 淀粉酶活性最高的条件为_。解析：(1)利用 PCR 技术扩增 淀粉酶基因前，需先获得细菌的基因组 DNA 作为模板，并依据 淀粉酶基因两端的部分核苷酸序列合成两条引物。(2)利用 PCR 技术扩增 DNA 时，只能从 3端延伸 DNA 子链，为了便于扩增的 DNA 片段与表达载体连接，需在引物的 5端加上限制性酶切位点，并且要注意在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，这样既能防止目的基因、载体的自身连接，又能确保目的基因与表达载体的定向连接。(3)PCR 技术包括变性、退火(复性)和延伸三步，变性温度决定 PCR 反应中双链 DNA 的
25、解链，且时间很短；退火时引物结合到互补的 DNA 单链上，退火温度由引物复性温度决定，其温度设定与引物的长度、碱基组成及浓度等有关；延伸时间与产物片段的长度有关，产物在 1 kb 以内的延伸时间为 1 min 左右，34 kb 的延伸时间为 34 min。(4)图中虚线框内共含有24 个碱基，mRNA 上 3 个相邻的碱基编码 1 个氨基酸，故共包含 8 个密码子。虚线框后的第1 个密码子的第 1 个碱基是 U，第 2 和第 3 个碱基各有 4 种可能性，因此共有 16 种可能性。题干表明控制 淀粉酶的基因有 1 656 个碱基对，说明图中虚线框后的第一个密码子肯定不是终止密码子(3 种终止密码子为 UAA、UAG、UGA)，故虚线框后第一个密码子实际最多有 16313(种)可能性。(5)分析表格中的数据，酶相对活性最高为 99.5%，对应的条件9是 pH 为 8.5，缓冲液为 50 mmol/L TrisHCl。答案：(1)基因组 DNA (2)5 使 DNA 片段能定向插入表达载体，减少自连 (3) (4)8 13(5)pH 为 8.5，缓冲液为 50 mmol/L TrisHCl
