1、FA1 17502 ISSN 0335-3931 NF X 31-255-2 Octobre 2001 - Indice de classement : X 31-255-2 ICs : 13.020.40 ; 13.080.30 Qualit du sol Effets des polluants vis-a-vis des escargots juvniles (Helix aspersa) Partie 2 : Dtermination des effets sur la croissance par contamination par le sol E : Soil quality -
2、 Effects of contaminants on juvenile land snails (Helix aspersa) - D : Bodenbeschaffenheit - Wirkungen von Schadstoffen auf Jungschnecken Part 2: Determination of the effects on growth by soil contamination (Helix aspersa) - Teil 2: Bestimmung der Wirkungen auf das Wachstum durch Bodenkontamination
3、Norme franaise homologue par dcision du Directeur Gnral d?AFNOR le 5 septembre 2001 pour prendre effet le 5 octobre 2001. Correspondance la date de publication du prsent document, il n?existe pas de travaux europens ou internationaux traitant du mme sujet. Analyse Le prsent document s?adresse aux la
4、boratoires ralisant des essais cotoxicologi- ques. II dcrit une mthode d?valuation de la toxicit des substances, prparations, sols ou dchets vis-vis d?escargots juvniles Helix aspersa aprs contamination par le sol. Des crip te Urs Thsaurus International Technique : sol, qualit, pollution, dchet, sub
5、stance toxi- que, toxicit, escargot, essai biologique, dtermination, contamination, croissance, mode Opratoire, calcul. Modifications Corrections dite et diffuse par l?Association Franaise de Normalisation (AFNOR) - 11, avenue Francis de Pressens - 93571 Saint-Denis La Plaine Cedex Tl. : + 33 (0)l 4
6、1 62 80 O0 - Fax : + 33 (0)l 49 17 90 O0 - www.afnor.fr O AFNOR 2001 AFNOR 2001 lertiage 2001-IO-F cotoxicoiog ie AFNOR T95E Membres de la commission de normalisation Prsident : M THYBAUD Secrtariat : MME THOMAS - AFNOR MME MME M M MME MME M MME M M M MME M MME M M M M M MME MME M MME M BAZIN BONNET
7、 BUREAU CABRIDENC CERBELAUD COTELLE DELOBEL FEIX GALVI N GANCET GARRIVIER JOURDAIN KHALANSKI LEDUC-BRUNET LEMAI RE LENON LHARI DON MARTINET PANDARD QUINIOU ROECK THYBAUD DE VAUFLEURY VI NDIMIAN INSAVALOR DIVISION POLDEN GDF INERIS AGHTM RHODIA CSEIEBSE METZ INSTITUT PASTEUR DE LILLE ADEME AGENCE DE
8、LEAU RHONE MEDITERRANNEE CORSE ATO FINA LABORATOIRE SANTE ENVIRONNEMENT HYGIENE DE LYON IRH EDF EDF ATO FINA CTP CIT CECIL SA INERIS IFREMER CENTRE DANALYSES ET DE RECHERCHE DILLKIRCH INERIS UFR SCIENCES ETTECHNIQUES BESANCON INERIS -3- NF X 31-255-2 Sommaire Page Introduction . 4 1 2 3 4 5 6 7 8 9
9、10 11 12 13 14 Domaine dapplication 4 Rfrences normatives 5 Termes et definitions . 5 Principe . 6 Environnement de lessai . 6 Reactifs . 7 Appareillage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 Conservation et prparation des chantillons 9 Mode opratoire Calculs et expression des rsultats Validite
10、 de lessai . 14 Contrle de la sensibilit du ractif biologique et de la conformit dapplication du mode opratoire . 14 Fidlit 15 Rapport dessai 15 ,. ,. . ., Annexe A (normative) Mthode statique . 16 Annexe B (informative) Technique dlevage des escargots Helix aspersa 17 Annexe C (informative) Exemple
11、 de composition daliment pour escargot . 21 Annexe D (informative) Exemple de tableau de donnes 22 Annexe E (informative) Exemple de rsultats 23 Bibliographie . 26 NF X 31-255-2 -4- Introduction Les problmes dvaluation de Icotoxicit des sols et des dchets sont lobjet de graves proccupations aussi bi
12、en au niveau national quinternational car lon dispose dun nombre restreint de donnes de toxicit des polluants sur les organismes du sol. Les tests actuellement disponibles utilisent des organismes de la faune du sol limits aux embranchements des annlides (vers de terre et Enchyfraeiae) et des arthro
13、podes (insectes : collemboles et ctoines ). Parmi ceux-ci, deux normes correspondent des tests de toxicit aigu (vers de terre I et larves de ctoines 2) et trois autres normes correspondent des tests subltaux (vers de terre 3, Enchyfraeiae, collemboles 4) concernant les effets de polluants du sol sur
14、 la reproduction. Or, dans les cycles biologiques des organismes, la croissance est au mme titre que la reproduction, un paramtre cophysiologique fondamental prendre en considration pour la prennit des espces et des cosystmes. Le test propos dans la prsente partie dcrit une mthode de dtermination de
15、s effets dune substance, dune prparation, dun sol ou dun dchet vis-vis de jeunes escargots Helix aspersa aspersa (escargot Petit Gris) aprs contamination par le sol. Une seconde partie dcrit une mthode de dtermination des effets dune subs- tance, dune prparation, dun sol ou dun dchet vis-vis de jeun
16、es escargots Helix aspersa aspersa aprs contamination alimentaire (5). En effet, en milieu naturel, ces animaux intgrent les pollutions par contact (avec divers substrats tels que litire vgtale, sol, lixiviat du sol), par ingestion (de vgtaux et de sol), ainsi que par la voie respiratoire. Lintrt de
17、s deux mthodes prsentes est de pouvoir estimer les effets de deux voies de contamination. Ces escargots terrestres (mollusques gastropodes pulmons stylommatophores de la famille des hlicids) sont ubiquistes. Dorigine europenne, ils ont t introduits dans toutes les parties du monde et se rencontrent
18、dans les diffrents continents (6). Les escargots constituent des indicateurs cologiques pertinents pour valuer la qualit des sols car ce sont des animaux caractristiques de la couche superficielle du sol (saprophages et phytophages) dont une partie impor- tante du cycle biologique se droule dans le
19、sol (ponte, closion, premiers stades du dveloppement, hiberna- tion,.). Pendant les autres phases de leur cycle, ils sont en contact avec le sol par leur sole pdieuse humide recouverte de mucus et participent des changes permanents avec le sol (eau, sels minraux, excrments et finalement coquille et
20、matire organique leur mort). Ils constituent de plus un relais important entre les vgtaux, la faune et les micro-organismes du sol. Ils rpondent compltement aux critres de bon indicateur biologique : facilement chantillonns et identifiables, ils ont une large distribution, accumulent certains pollua
21、nts (7), 8, 12, I 51, 20, 21), possdent des caractristiques cologiques et physiologiques bien connues et sont maintenant facilement levs en conditions contrles (I 61, 23). Leur sensibilit la contamination de leur environnement a t dmontre (7 22 et 24 28). 1 Domaine dapplication Le prsent document dc
22、rit une mthode semi-statique pour la dtermination des effets des polluants sur la crois- sance et sur la mortalit vis vis de jeunes escargots Helix aspersa aspersa aprs contamination par le sol (voie cutane et digestive). La mthode dcrite est applicable : - aux substances chimiques et prparations ;
23、- aux sols et dchets. Une mthode statique peut tre mise en uvre en complment de la mthode semi-statique (facultatif). Cette mthode est dcrite en annexe A. La prsente mthode nest pas applicable aux substances volatiles, cest dire les substances pour lesquelles la constante de Henry, H ou le coefficie
24、nt de partage aideau est suprieur 1, ou pour lesquelles la pression de vapeur est suprieure 0,0133 Pa 25 OC. Cet essai tient compte de lventuelle volution de la substance, de la prparation ou de la matrice exprimenter car le mlange dessai est prpar et renouvel tous les sept jours durant les 28 jours
25、 de lessai. -5- NF X 31-255-2 2 Rfrences normatives Le prsent document comporte par rfrence date ou non date des dispositions dautres publications. Ces rf- rences normatives sont cites aux endroits appropris dans le texte et les publications sont numres ci-aprs. Pour les rfrences dates, les amendeme
26、nts ou rvisions ultrieurs de lune quelconque de ces publications ne sappliquent ce document que sils y ont t incorpors par amendement ou rvision. Pour les rfrences non dates, la dernire dition de la publication laquelle il est fait rfrence sapplique. NF IS0 10381 -6, Qualif du sol - chanfillonnage -
27、 Partie 6 : Lignes direcfrices pour la collecfe, la manipulafion ef la conservafion des sols desfins une fude en laborafoire des processus microbiens arobies (indice de classement : X 31-008-6). NF IS0 10390, Qualif du sol - Dferminafion du pi (indice de classement : X 31-1 17). FD IS0 11268-1 :I 99
28、4, Qualif du sol - Effefs des polluanfs vis-vis des vers de ferre -Partie 1 : Dferminafion de la foxicif aigu en ufilisanf des subsfrafs de sol artificiel (indice de classement : X 31-251). NF IS0 1 1274, Qualif du sol - Dferminafion de la caracfrisfique de la rfenfion en eau - Mfhodes de labo- rafo
29、ire (indice de classement : X 31-551). NF IS0 1 1465, Qualif du sol - Dferminafion de la feneur pondrale en mafire sche ef en eau - Mfhode gravimfrique (indice de classement : X 31-102). FD IS0 14238:1997, Qualif du sol - Mfhodes biologiques - Dferminafion de la minralisafion de Iazofe ef de la nifr
30、ificafion dans les sols, ef de linfluence des produifs chimiques sur ces processus (indice de classement : X 31-225). 3 Termes et dfinitions Pour les besoins du prsent document, les termes et dfinitions suivants sappliquent. 3.1 substrat dessai substrat artificiel ou sol naturel 3.2 matrice sol ou d
31、chet exprimenter 3.3 mlange dessai mlange de la substance, de la prparation ou de la matrice exprimenter avec le substrat dessai 3.4 croissance augmentation de la biomasse, cest dire de la masse fraiche totale (corps et coquille) des organismes et aug- mentation du grand diamtre de coquille, entre l
32、e dbut et la fin de lessai. La croissance est exprime sous forme dun coefficient de croissance. 3.5 CE x concentration de la substance, de la prparation ou de la matrice exprimenter provoquant une inhibition de x % de la croissance la fin de lessai, par rapport lessai tmoin 3.6 CE 50 concentration d
33、e la substance, de la prparation ou de la matrice exprimenter provoquant une inhibition de 50 % de la croissance la fin de lessai, par rapport lessai tmoin NF X 31-255-2 -6- 3.7 CL 50 concentration ltale mdiane, cest dire la concentration de substance, de la prparation exprimenter initia- lement prs
34、ente ou la concentration de la matrice provoquant la mort de 50 % des animaux soumis lessai 3.8 concentration maximale sans effet observ (CSEO) concentration dessai la plus leve de la substance, de la prparation ou de la matrice exprimenter pour laquelle aucun effet statistiquement significatif na t
35、 constat par rapport lessai tmoin NOTE La CSEO est la concentration immdiatement infrieure la CMEO. 3.9 concentration minimale avec effet observ (CMEO) concentration dessai la plus faible de la substance, de la prparation ou de la matrice exprimenter pour laquelle un effet statistiquement significat
36、if a t constat par rapport lessai tmoin 4 Principe Des escargots juvniles Helix aspersa sont exposs pendant une priode de 28 jours un substrat dessai con- tenant la substance, la prparation ou la matrice exprimenter diffrentes concentrations. Le substrat dessai contamin est fraichement prpar et reno
37、uvel tous les sept jours. Selon les objectifs de lutilisateur, le substrat dessai pourra tre prpar avec du substrat artificiel ou avec un sol naturel appropri. Les animaux sont nourris pendant lessai avec un aliment pour escargots non contamin. Les effets sur la croissance (masse fraiche et diamtre
38、de coquille) et sur la mortalit sont mesurs tous les sept jours pendant 28 jours. Les rsultats obtenus lors des essais sont compars ceux dun essai tmoin et utiliss pour estimer la concentration qui rduit de 50 % la croissance des escargots en 28 jours par rapport la masse fraiche (CE, 50 - 28 jours)
39、 et au diamtre de coquille (CEd 50 - 28 jours). II est galement possible (facultatif) de dterminer la CSEO ou CMEO ou dautres valeurs de CE x. Lorsque les donnes sont adquates, les rsultats obtenus lors des essais sont compars avec ceux dun essai tmoin et utiliss pour estimer la concentration qui pr
40、ovoque la mortalit de 50 % des escargots (CL 50 -28 jours). Pour des applications particulires, les diffrents paramtres (CE x, CSEO, CMEO, CL 50) peuvent tre dtermi- ns (facultatif) aprs des dures dexposition infrieures 28 jours (7, 14 ou 21 jours). Rgulirement, un essai destin contrler la stabilit
41、du matriel biologique est ralis laide dune substance de rfrence. NOTE Lexprience a montr que le chlorure de cadmium est une substance de rfrence approprie. Lessai est conduit en deux tapes : - un essai prliminaire qui donne une indication approximative des concentrations responsables de labsence din
42、hibition de croissance dune part et de linhibition complte de la croissance dautre part. Cet essai sert dfinir la gamme des concentrations de lessai dfinitif ; - un essai dfinitif qui dtermine les concentrations provoquant entre 10 % et 90 % dinhibition de croissance. II nest pas ncessaire de ralise
43、r un essai dfinitif lorsque lessai prliminaire na pas mis en vidence deffets inhibiteurs la concentration maximale teste. 5 Environnement de lessai Les essais doivent tre raliss la temprature de 20 “C I2 “C sous un cycle jour/nuit de 18 h/6 h. Lintensit de lclairement (lumire artificielle type lumir
44、e du jour, sans apport de lumire naturelle) dans les rcipients dessai est de lordre de 50 Ix 100 Ix. -7- NF X 31-255-2 6 Ractifs 6.1 Eau, au minimum dionise 6.2 Matriel biologique Le matriel biologique est constitu descargots juvniles Helix aspersa aspersa gs de trois cinq semaines et dont la masse
45、fraiche moyenne est de 1 g I0,3 g et le grand diamtre de la coquille de 15,5 mm I 1 mm. Les escargots doivent provenir dun levage synchrone pour former une population aussi homogne que possible du point de vue de la taille, de la masse et de lge. Les techniques dlevage des escargots sont dcrites en
46、annexe B. Aprs la priode de nursery (de trois cinq semaines ; voir annexe B), les escargots juvniles doivent tre utiliss aprs une semaine destivation au minimum cinq mois destivation au maximum. Lestivation est ra- lise dans des boites circulaires en bois usage alimentaire (diamtre de 12 cm environ,
47、 hauteur de 4 cm environ), les animaux tant au sec, une temprature de 17 OC 20 OC. Rveiller les animaux par pulvrisation deau (6.1) dans les boites utilises pour lestivation, deux trois jours avant le dbut de lessai. La mortalit au rveil doit tre infrieure 10 %. Ds quils ont repris de lactivit (ani- maux non colls aux parois de la boite et qui commencent se dplacer), transfrer les animaux dans une boite (7.1) humidifie avec de leau (6.1). Le fond de cette boite de rveil) peut tre recouvert de papier absor- bant galement hu
