1、1基因工程1.(2017 全国卷)编码蛋白甲的 DNA 序列(序列甲)由 A、B、C、D、E 五个片段组成,编码蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段组成,如图 1 所示。图 1图 2回答下列问题。(1)现要通过基因工程的方法获得蛋白乙,若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的 DNA 序列(TTCGCTTCTCAGGAAGGA),则所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙,原因是。 (2)某同学在用 PCR 技术获取 DNA 片段 B 或 D 的过程中,在 PCR 反应体系中加入了 DNA 聚合酶、引物等,还加入了序列甲作为 ,加入了 作为合成 DNA 的原料。 (3)现通过基因工程的方法获得
2、了甲、乙、丙三种蛋白,要鉴定这三种蛋白是否具有刺激 T 淋巴细胞增殖的作用,某同学做了如下实验:将一定量的含 T 淋巴细胞的培养液平均分成四组,其中三组分别加入等量的蛋白甲、乙、丙,另一组作为对照,培养并定期检测 T 淋巴细胞浓度,结果如图 2。由图 2 可知:当细胞浓度达到 a 时,添加蛋白乙的培养液中 T 淋巴细胞浓度不再增加,此时若要使T 淋巴细胞继续增殖,可采用的方法是 。细胞培养过程中,培养箱中通常要维持一定的 CO2浓度,CO 2的作用是 。 仅根据图 1、图 2 可知,上述甲、乙、丙三种蛋白中,若缺少 (填“A”“B”“C”“D”或“E”)片段所编码的肽段,会降低其刺激 T 淋巴
3、细胞增殖的效果。 答案 (1)编码乙的 DNA 序列起始端无 ATG,转录出的 mRNA 无起始密码子(2)模板 dNTP(3)进行细胞传代培养 维持培养液的 pH C2解析 (1)由基因乙的碱基序列可知,由该序列转录出的 mRNA 无起始密码子,所以在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的 DNA 序列后,所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙。(2)PCR 反应体系中除了加入 DNA 聚合酶、引物等,还应加入序列甲作为模板,加入四种脱氧核苷酸(dNTP)作为合成 DNA 的原料。(3)当细胞浓度达到 a 时,T 淋巴细胞的浓度不再增加,是因为出现了接触抑制现象,所以可以进行细胞传代培养,
4、使 T 淋巴细胞继续增殖;细胞培养过程中,培养箱中通常要维持一定的 CO2浓度,CO 2的作用是维持培养液中的 pH。根据图 2 可知,甲、乙两组的 T 淋巴细胞数量多,丙组的 T 淋巴细胞数量少,根据图 1 比较可知,丙组 T 淋巴细胞少的原因是蛋白丙缺少 C 片段所编码的肽段。2.科学家从某细菌中提取抗盐基因,转入烟草并培育成转基因抗盐烟草。下图是转基因抗盐烟草的培育过程,含目的基因的 DNA 和质粒上的箭头表示相关限制酶的酶切位点。请分析回答下列问题。(1)在该过程中,研究人员首先获取了抗盐基因(目的基因),并采用 技术对目的基因进行扩增,该技术需要的条件是 、酶、原料、模板,该技术必须
5、用 酶;然后构建基因表达载体,基因表达载体中除了具有目的基因、启动子和终止子之外,还需具有 。 (2)用图中的质粒和目的基因构建重组质粒,不能使用 Sma酶切割,原因是 。图中过程为防止质粒和含目的基因的外源 DNA 片段自身环化,应选用 酶对外源 DNA、质粒进行切割。 (3)为确定转基因抗盐烟草是否培育成功,既要用放射性同位素标记的 作探针进行分子杂交检测,又要在个体水平上鉴定,后者具体过程是 。 答案 (1)PCR(聚合酶链式反应) 引物 耐热的 DNA 聚合酶或热稳定性的 DNA 聚合 标记基因(2)Sma会破坏质粒的抗性基因和外源 DNA 中的目的基因 BamH和 Hind(3)抗盐
6、基因(或目的基因) 将培育的烟草幼苗栽培于含有一定盐的土壤中,观察该烟草植株的生长状态解析 (1)依题意可知,抗盐基因属于目的基因,可采用 PCR(聚合酶链式反应)技术扩增目的基因,该技术需要的条件是引物、酶、原料、模板,利用 PCR 技术扩增目的基因时,每次循环都是在 9095 时进行变性、在 5560 时进行复性、在 7075 时延伸,所以该技术需要用热稳定 DNA 聚合3酶(或 Taq DNA 聚合酶)。基因表达载体由目的基因、启动子、终止子、标记基因等组成。(2)题图显示,质粒上的 M 抗生素抗性基因和目的基因中都含有 Sma 酶的识别和酶切位点,若使用 Sma 酶切割,会破坏质粒的抗
7、性基因和外源 DNA 中的目的基因,因此不能使用 Sma 酶切割。抗盐基因(或目的基因)的两侧都有 EcoR 酶的识别和酶切位点,因此用 EcoR 酶切割目的基因会出现自身环化; BamH 和 Hind 识别和酶切位点分别位于目的基因的两侧,而且质粒中也有相应的酶切位点,因此用 BamH 和 Hind同时进行酶切,才能完整地切下该抗盐基因,同时保证目的基因与质粒的连接方式的唯一性,防止质粒和含目的基因的外源 DNA 片段自身环化。(3)检测目的基因是否导入受体细胞,在分子水平上进行检测时,要用放射性同位素标记的抗盐基因(或目的基因)作探针进行分子杂交检测;在个体水平上进行鉴定时,可将培养的烟草
8、幼苗栽培于含有一定盐的土壤中,观察该植株的生长状态。3.将苏云金杆菌 Bt 蛋白的基因导入棉花细胞中,可获得抗棉铃虫的转基因棉,其过程如下图所示。注 质粒中“Bt”代表“Bt 基因”,“Km R”代表“卡那霉素抗性基因”。农杆菌中 Ti 质粒上只有 T-DNA 片段能转移到植物细胞中。(1)过程需用同种 酶对含 Bt 基因的 DNA 和 Ti 质粒进行酶切。为将过程获得的含重组质粒的农杆菌筛选出来,应使用 培养基。 (2)过程中将棉花细胞与农杆菌混合后共同培养,旨在让 进入棉花细胞;除尽农杆菌后,还须转接到含卡那霉素的培养基上继续培养,目的是 。 (3)若过程仅获得大量的根,则应在培养基中增加
9、 以获得芽;部分接种在无激素培养基上的芽也能长根,原因是 。 (4)检验转基因棉的抗虫性状,常用方法是 。种植转基因抗虫棉能减少 的使用,以减轻环境污染。 答案 (1)限制性核酸内切 选择(2)T-DNA 筛选获得含 T-DNA 片段的植物细胞(3)细胞分裂素浓度 芽顶端合成的生长素向基部运输,促进根的分化(4)投放棉铃虫 农药解析 (1)目的基因与质粒构建基因表达载体时需要用同种限制性核酸内切酶对二者进行切割。要筛选出含重组质粒的农杆菌应使用选择培养基。(2)为将目的基因导入受体细胞,应先将重组质粒4导入农杆菌,再用农杆菌感染棉花细胞,从而将 T-DNA 整合至棉花细胞染色体的 DNA 上;
10、除尽农杆菌后,因重组质粒中含有卡那霉素抗性基因,在含有卡那霉素的培养基上继续培养可筛选获得含 T-DNA 片段的植物细胞。(3)愈伤组织培养过程中,生长素能促进根的分化,细胞分裂素能促进芽的分化,在培养过程中芽顶端合成的生长素也可促进根的分化。(4)在个体水平检测抗虫棉的抗虫性状,可投放棉铃虫,观察棉铃虫的生存情况。种植转基因抗虫棉能减少农药的使用,从而减轻环境污染。4.人血清白蛋白(HSA)具有重要的医用价值,原来只能从人血浆中提取。下图是以基因工程技术获取重组 HSA(rHSA)的两条途径。(1)为获取 HSA 基因,首先需采集人的血液,提取 合成总 cDNA,然后以 cDNA 为模板,使
11、用 PCR 技术扩增 HSA 基因。下图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向,请用箭头在方框内标出另一条引物的位置及扩增方向。 (2)启动子通常具有物种及组织特异性,构建在水稻胚乳细胞内特异表达 rHSA 的载体,需要选择的启动子是 (填写字母,单选)。 A.人血细胞启动子 B.水稻胚乳细胞启动子C.大肠杆菌启动子 D.农杆菌启动子(3)利用农杆菌转化水稻受体细胞的过程中,需添加酚类物质,其目的是 。 (4)人体合成的初始 HSA 多肽,需要经过膜系统加工形成正确空间结构才有活性。与途径相比,选择途径获取 rHSA 的优势是 。 (5)为证明 rHSA 具有医用价值,须确认 rHSA 与
12、 的生物学功能一致。 答案 (1)总 RNA(或 mRNA)(2)B(3)吸引农杆菌移向水稻受体细胞,有利于目的基因成功转化(4)水稻是真核生物,具有膜系统,能对初始 rHSA 多肽进行高效加工(5)HSA5解析 (1)目的基因的获取途径之一是逆转录法,即以 RNA 为模板合成目的基因,故需要提取相关的RNA。PCR 技术利用的是 DNA 复制的原理,由于 DNA 分子的两条链是反向平行的,而 DNA 的合成方向总是从子链的 5端向 3端延伸,故另一条子链的扩增方向相反。(2)启动子通常具有物种及组织特异性,要构建在水稻胚乳细胞内特异表达 rHSA 的载体,需选择水稻胚乳细胞启动子。(3)利用
13、农杆菌转化水稻受体细胞时,由于酚类物质能够吸引农杆菌移向水稻受体细胞,有利于目的基因成功转化,故需添加酚类物质。(4)由于真核细胞中具有膜系统,途径中的水稻胚乳细胞能对初始 rHSA多肽进行加工,使 rHSA 具有生物学活性。(5)由题意知,要制备有医用价值的 rHSA,需要 rHSA 与HSA 的生物学功能一致。5.(2018 江苏卷)为生产具有特定性能的 -淀粉酶,研究人员从某种海洋细菌中克隆了 -淀粉酶基因(1 656 个碱基对),利用基因工程大量制备 -淀粉酶,实验流程见下图。请回答下列问题。(1)利用 PCR 技术扩增 -淀粉酶基因前,需先获得细菌的 。 (2)为了便于扩增的 DNA
14、 片段与表达载体连接,需在引物的 端加上限制性酶切位点,且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点,主要目的是 。 (3)进行扩增时,反应的温度和时间需根据具体情况进行设定,下列选项中 的设定与引物有关, 的设定与扩增片段的长度有关。(填序号) 变性温度 复性温度 延伸温度 变性时间 复性时间 延伸时间(4)下图表示筛选获得的工程菌中编码 -淀粉酶的 mRNA 的部分碱基序列:5-AUGCCAUCAACAAAUACUAACACUU-3图中虚线框内 mRNA 片段包含 个密码子,如虚线框后的序列未知,预测虚线框后的第一个密码子最多有 种。 (5)获得工程菌表达的 -淀粉酶后,为探究影响酶活性的
15、因素,以浓度为 1%的可溶性淀粉为底物测定酶活性,结果如下:缓冲液50 mmol/L Na2HPO4-KH2PO450 mmol/L Tris-HCl50 mmol/L Gly-NaOHpH 6.0 6.5 7.0 7.5 7.5 8.0 8.5 9.0 9.0 9.5 10.0 10.56酶相对活性%25.440.249.863.270.195.599.585.368.163.741.520.8根据上述实验结果,初步判断该 -淀粉酶活性最高的条件为 。 答案 (1)基因组 DNA (2)5 使 DNA 片段能定向插入表达载体,减少自连 (3) (4)8 13 (5)pH 为 8.5,缓冲液为
16、 50 mmol/L Tris-HCl解析 (1)从海洋细菌中利用 PCR 技术扩增 -淀粉酶基因,首先要获得细菌的基因组 DNA,再利用引物来获取 -淀粉酶基因。(2)由于 PCR 技术合成子链的方向是 53,引物是与子链连接的 DNA单链或 RNA 链,所以应在引物的 5端加上限制性酶切位点。为保证 DNA 片段能定向插入表达载体中,避免 DNA 片段和载体自身环化以及 DNA 片段和表达载体任意拼接,常在两条引物上设计不同的限制性酶切位点。(3)引物与模板链结合属于复性,所以复性温度的设定与引物有关,扩增片段属于延伸,扩增片段的长度与延伸的时间有关。(4)密码子是指 mRNA 上 3 个
17、相连的碱基,虚线框内有 24 个碱基,共构成 8 个密码子。虚线框后第一个密码子的第一个碱基是 U,共可构成的密码子种类有44=16(种),又因图中碱基序列仅是编码 -淀粉酶的 mRNA 的一部分,此密码子不可能是终止密码子(3 种,UAA、UAG、UGA),所以虚线框后的第一个密码子共有 13 种。(5)根据表格数据可知,-淀粉酶活性最高时的条件是 pH 为 8.5,缓冲液为 50 mmol/L Tris-HCl。6.大豆花叶病毒(RNA 病毒)是世界性大豆病害,是造成大豆减产的重要原因。某科研小组制备了大豆花叶病毒的空衣壳蛋白(CP 蛋白),生产过程大致如下,请回答问题。(1)图中的是指
18、。 (2)过程中应用的酶是 。此过程中先要在大豆花叶病毒的基因文库中查找 的核苷酸序列,以便合成特异性引物。 (3)在上述生产流程中, (填序号)是基因工程生产 CP 衣壳蛋白的核心步骤。为检测样液中是否含有有效成分,在过程中可使用 进行检测。 答案 (1)RNA (2)Taq DNA 聚合酶 CP 蛋白基因(控制 CP 蛋白合成的 RNA 片段)7(3) CP 蛋白的抗体解析 (1)因为通过获得的是 cDNA,所以是 RNA,过程是逆转录。(2)过程是 PCR 扩增,在该技术中需要用到耐高温的 Taq DNA 聚合酶。在该过程中,需要先知道目的基因,即 CP 蛋白基因的核苷酸序列,才能合成特异性引物。(3)在基因工程中基因表达载体的构建是核心,即步骤是核心步骤。为了检测样液中是否含有有效成分,在过程中可以用抗原抗体杂交,即使用 CP 蛋白的抗体进行检测。如果出现了杂交带,则说明含有有效成分。
