1、ICS DB51 四川省地方标准 DB51/T 10982010 牛奶中磺胺二甲氧嘧啶残留检测方法 酶联免疫吸附测定(ELISA)法 Determination of Residues Sulfadimethoxine in Milk by Enzyme-linked Immunosorbent Assay 2010 - 06 - 01 发布 2010 - 07 - 01 实施四川省质量技术监督局 发布DB51/T 19082010 I 目 次 前言 错误！未定义书签。 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 制样 . 1 4 测定方法 . 1 5 测方法灵敏度、准确度、精密度 .
2、3 DB51/T 19082010 II 前 言 本标准由四川省畜牧食品局提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准起草单位：四川省兽药监察所、四川省兽药残留监控中心。 本标准主要起草人：吴晓岚、程江、彭莉、岳秀英、熊浩山、官艳丽、王海波。 DB51/T 19082010 1 1 2 3 4 牛奶中磺胺二甲氧嘧啶残留检测方法 酶联免疫吸附测定(ELISA) 法 范围 本标准规定了牛奶中磺胺二甲氧嘧啶残留量检测的制样和快速检测酶联免疫吸附测定方法。 本标准适用于牛奶中磺胺二甲氧嘧啶的残留量的快速筛选检测，最低检测限为1.2 g/L，可疑样品应用仪器方法进行确认。 规范性引用文件 下
3、列文件对于本文的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规则和实验方法 制样 3.1 样品的制备 取新鲜或解冻的空白或供试牛奶，涡旋混合使之均匀，密封。 3.2 样品的保存 -20以下冰箱中贮存备用。 测定方法 4.1 方法提要或原理 牛奶中残留的磺胺二甲氧嘧啶用冷冻离心除脂，酶联免疫吸附测定法测定,其基本原理是抗原抗体反应。在酶联板的微孔条上预包被偶联抗原,标样或样品中的磺胺二甲氧嘧啶与酶标记抗原竞争磺胺二甲氧嘧啶特异性抗体。通过洗涤除去没有与特异性抗体结合的酶标
4、记抗原。加入底物液，结合到板上的酶标记物将底物转化为有色产物。加入终止液，在450nm处测定吸光度值，吸光度值与试样中磺胺二甲氧嘧啶浓度呈反比,与标准曲线比较即可得出磺胺二甲氧嘧啶残留含量。 4.2 试剂和材料 以下所有试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂；水为符合GB/T 6682规定的二级水。 4.2.1 十二水合磷酸氢二钠（Na 2HP04.12H20），二水合磷酸二氢钾（KH 2P04.2H20），氯化钠（NaCl），氯化钾（KCl）。 4.2.2 0.02M PBS 缓冲液 称取 5.36 g 十二水合磷酸氢二钠、0.20 g 二水合磷酸二氢钾、8.00g 氯化钠和 0.20g 氯化钾
5、加去离子水溶液定容至 1L。 4.2.3 磺胺二甲氧嘧啶试剂盒：28保存。（采用官方备案的试剂盒） 4.2.3.1 96 孔板酶标板 8 条 12 孔：包被有磺胺二甲氧嘧啶偶联抗原。 4.2.3.2 磺胺二甲氧嘧啶系列标准溶液 0.0 g/L 、 1.0g/L、 3.0g/L、9.0 g/L、 27.0g/L、 81.0g/L。 4.2.3.3 酶标二抗。 4.2.3.4 抗体工作液。 4.2.3.5 底物溶液 A。 4.2.3.6 底物溶液 B。 DB51/T 19082010 2 4.2.3.7 浓缩洗涤液 临用前用水稀释二十倍作为洗涤液。 4.2.3.8 浓缩复溶液 临用前用水 1：1
6、稀释。 4.2.3.9 终止溶液。 4.3 仪器和设备 4.3.1 酶标仪（配备 450nm 滤光片）。 4.3.2 天平 感量 0.01g。 4.3.3 分析天平 感量 0.0001g。 4.3.4 漩涡混合器。 4.3.5 氮吹仪。 4.3.6 冷冻离心机。 4.3.7 振荡器。 4.3.8 离心管 20mL。 4.3.9 微量移液器 单道 50 L，100 L，1000 L多道50 L -250L。 4.4 测定步骤 4.4.1 试料的制备 试料的制备包括： 取制备后的供试样品,作为供试试料。 取制备后的空白样品,作为空白试料。 取制备后空白样品,添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加试料。
7、 4.4.2 提取 取制备后的试样5.0 mL于离心管中，300 0r/min，10离心10min，吸除上层脂肪；取lml离心后的牛奶样本，用0.02MPBS缓冲液（见配液3）按1：19的体积比进行稀释（即20 l牛奶380 l0.02MPBS缓冲液）；最后取20 l用于分析。 4.4.3 样品测定程序（2026条件下操作） 4.4.3.1 使用前将试剂盒置于室温（2026）平衡 30min 以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的酶标板微孔条插入框架中，将不用的微孔条放入自封袋，保存于 28。将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品均需做两个平行实验。 4.4.3.2 加
8、入 50 L 标准溶液或试样溶液到微孔底部，随即加入酶标二抗 50 l/孔，再加入抗体工作液50l/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜封板，25温箱中避光反应 60 min。 4.4.3.3 加入 50 L 底物溶液 A 和 50 L 底物溶液 B 到微孔中，轻轻振荡混匀 25避光环境显色 30min。 4.4.3.4 加入 50 L 终止液到微孔中，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于 450nm 处，测定每孔吸光度值（OD值）。 4.5 结果计算和表述 所获得的标准或样品吸光度值的平均值除以第一个标准（0标准）吸光度值的平均值再乘以100%，得到以百分比给出的吸光度值，以式（1.1）表示： 相对吸光度值0(
9、%)BB= 100% 1.1 式中: B为标准溶液或供试样品的平均吸光度值； B0为零浓度标准溶液的平均吸光度值。 以X轴为标准溶液中磺胺二甲氧嘧啶浓度( g/L)的自然对数，Y轴为百分吸光度值，在半对数坐标纸上绘制标准曲线图。相对应的供试样品的浓度（ g/L）可以从标准曲线上查出。也可以求出回归曲DB51/T 19082010 3 5 线的方程，计算未知样品中磺胺二甲氧嘧啶的浓度。如果有专业计算机软件可直接求出供试样中磺胺二甲氧嘧啶的浓度。 注：检测结果小于20.0 g/L时，可判为未检出，大于20.0 g/ L时，判为可疑，需用确证法确认。 测方法灵敏度、准确度、精密度 5.1 灵敏度 本方法在牛奶中磺胺二甲氧嘧啶的最低检测限为1.20 g/L。 5.2 准确度 本方法在牛奶中20.0 g/L80.0 g/L添加浓度的回收率为70.0%- 110.0%。 5.3 精密度 本方法的批内变异系数CV 14.0%；批间变异系数CV 11.0%。 _
