1、 ICS:65.020.30 DB51B 40 备案号： 23071-2008 四川省地方标准DB51/T797-2008鸡蛋中氯霉素残留量的测定- 高效液相色谱-串联质谱（LC-MS-MS）法Determination of Chloramphenicol Residues in Egg by High Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry 2008-06-06 发布 008-06-15 实施四川省质量技术监督局发布DB51/T797-2008 I 目 次 前言 . II 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3
2、 制样 1 4 测定方法 1 5 检测方法灵敏度、准确度和精密度 4 附录A （资料性附录） 氯霉素特征离子质量色谱图、特征离子质谱图 . 5 DB51/T797-2008 II 前 言 进的检测方法即高效液相色谱-串联质谱法来作为检测手段，使其定量限满足欧盟要求，以加强控制鸡蛋中氯霉素的残留，保证鸡蛋的质量安全，维护广大消费者的切身利益。最终研究建立了鸡蛋中氯霉素残留量的检测方法高效液相色谱-串联质谱LC-MS-MS法 本标准按GB/T1.12000 标准的结构和编写规则进行编制，GB/T 1.22000标准化工作导则 第2部分：标准中规范性技术要素内容的确定方法进行修改。 本标准附录A是资
3、料性附录。 本标准由四川省畜牧食品局提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准发布。 本标准起草单位：四川省兽药监察所、四川省兽药残留监控中心。 本标准主要起草人：彭莉、岳秀英、熊浩山、官艳丽、王海波、吴晓岚 DB51/T797-2008 1 鸡蛋中氯霉素残留量的测定- 高效液相色谱-串联质谱（LC-MS-MS）法 1 范围 本标准规定了鸡蛋中氯霉素残留检测的制样和高效液相色谱-串联质谱（LC-MS-MS）测定方法。 本标准适用于鸡蛋中氯霉素残留量的测定。定量限为0.2 g/kg。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修
4、改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T 6682-1992 分析实验室用水规则和试验方法 3 制样 3.1 样品的制备 取适量新鲜或恢复至室温的空白和供试去壳全蛋，匀浆使之均匀，密封。 3.2 样品的保存 -20C以下贮存备用。 4 测定方法 4.1 方法提要或原理 经乙腈-水溶液提取，正己烷去脂，乙酸乙酯重复提取，C18固相萃取柱净化后，用高效液相色谱串联质谱仪测定，氘代氯霉素内标法定量。 4.2 试剂和材料 以下所用试剂，除特别注明者外均为分析纯，水为符
5、合 GB/T6682 规定的二级水。 4.2.1 氯霉素 含氯霉素（C 11H12Cl2N2O5）不得少于 98% 4.2.2 氘代氯霉素 含氘代氯霉素（C 11H7D5Cl2N2O5）不少于 98.5% 4.2.3 乙腈 色谱纯 4.2.4 甲醇 色谱纯 4.2.5 盐酸 4.2.6 乙酸乙酯 4.2.7 正己烷 4.2.8 0.1mol/L 盐酸溶液 4.2.9 （84+16）乙腈-水溶液 4.2.10 （5+95）乙腈-水溶液 4.2.11 （50+50）乙腈-水溶液 4.2.12 氯霉素标准储备液 取氯霉素约 10mg，精密称定，置 100mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀释成浓度为 100
6、 g/mL 氯霉素标准储备液。置-20保存，保存期不超过 1 年。 4.2.13 氯霉素内标储备液 取100 g/mL 氘代氯霉素，精密量取，置 100mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀释成浓度为 1 g/mL 氯霉素内标储备液。置-20保存，保存期不超过 6 个月。 DB51/T797-2008 2 4.2.14 氯霉素标准工作液 准确取适量氯霉素标准储备液，用流动相稀释成适宜浓度的氯霉素标准工作液。-20以下保存，有效期不超过 3 个月。 4.2.15 20ng/mL 氯霉素内标工作液 准确取适量氯霉素内标储备液，用流动相稀释成含氘代氯霉素为20ng/mL 的内标工作液。-20以下保存，有效期不
7、超过 3 个月。 4.2.16 C18固相萃取柱（500mg/3mL） 4.3 仪器和设备 4.3.1 高效液相色谱串联质谱仪（配电喷雾离子源） 4.3.2 天平 感量 0.01g 4.3.3 分析天平 感量 0.00001g 4.3.4 涡旋振荡器 4.3.5 组织匀浆器 4.3.6 冷冻离心机 4.3.7 样品浓缩仪 4.3.8 固相萃取装置 4.3.9 离心管 10mL，50mL 4.3.10 微孔滤膜 0.22 m 4.4 测定步骤 4.4.1 试料的制备 试料的制备包括： 取匀浆后的供试样品，作为供试材料。 取匀浆后的空白样品，作为空白材料。 取匀浆后的空白样品，添加适宜浓度的标准溶
8、液作为空白添加试料。 4.4.2 提取 称取（5 0.05）g试料，置于50mL离心管中，精密加入20ng/mL氘代氯霉素内标工作溶液500 L，然后加入0.1mol/L 盐酸溶液1mL，（84+16）乙腈-水 溶液8mL溶液，混合震荡5min，以5000rpm离心10min 。重复一次，合并两次提取液于另一50mL离心管中。加正己烷8mL，涡旋振荡5min，5000rpm离心5min，弃上清液，重复一次。然后再加乙酸乙酯5mL，涡旋振荡5min，6000rpm离心5min，取上清液于鸡心瓶中，重复一次，合并两次提取液，50 C下减压蒸干。用（5+95）乙腈-水溶液3mL溶解残留物，备用。 4
9、.4.3 净化 固相萃取柱依次用甲醇 10mL，水 10mL 预洗活化，取备用液过柱，保持流速在 1mL/min 左右洗脱。用水 4mL 洗柱，然后用（50+50）乙腈-水溶液 4mL 将样品洗脱至离心管中。洗脱液中加乙酸乙酯 4mL，涡旋振荡 1min，5000rpm 离心 5min，取上清液，重复提取一次，合并提取液，氮气下吹干。 用（50+50）乙腈-水溶液1mL溶解残留物，涡旋过0.22 m滤膜后供高效液相色谱-串联质谱测定。 4.4.4 标准曲线的制备 精密量取氯霉素标准工作液和氘代氯霉素内标工作液适量，用流动相稀释成氯霉素浓度分别为0.5 、1.0、2.0、5.0、10.0 g/L
10、, 氘代氯霉素内标浓度为10.0 g/L的工作液供高效液相色谱-串联质谱测定。 4.5 测定 4.5.1 液相色谱条件 色谱仪：Waters 2695高效液相色谱仪或相当者 色谱柱：AtlantisTM C18 (2.1mm150mm，5m) 或相当者 柱温：30 流速：0.2mL/min 进样量：20L DB51/T797-2008 3 运行时间：8min 流动相：乙腈+水（50+50） 4.5.2 质谱条件 质谱仪：Waters Quattro Premier XE 或相当者 电离模式：ESI- 扫描方式：负离子扫描 检测方式：多反应检测 电离电压：2.8KV 源温：120 雾化温度：35
11、0 锥孔气流速：50L/h； 雾化气流速：450L/h； 数据采集窗口：8min 驻留时间：0.2sec 定性、定量离子及对应的锥孔电压和碰撞电压见表 1 表 1 氯霉素定性、定量离子对和锥孔电压及碰撞电压 药物 定性离子对 (m/z) 定量离子对 (m/z) 锥孔电压(V) 碰撞电压(V) 321/152 15 氯霉素（CAP） 321/257 321/152 30 13 氘代氯霉素 326/157 326/157 28 18 4.5.3 测定法 取试样溶液和相应的对照溶液，做标准曲线校准，按内标法以峰面积计算，即得。空白试样、对照溶液和试样溶液中各特征离子的质量色谱图分别见附录A 4.5.
12、4 空白试验 4.6 结果计算 随行标准曲线制备：计算A 321152/A326157峰面积比值，标准曲线校准。 由标准曲线方程 求得 a 和 b，则 然后按下式计算供试组织中氯霉素残留量： 式中： As对照溶液中氯霉素的峰面积； Ais对照溶液中内标的峰面积； cs对照溶液中氯霉素标准品的浓度（ g/L）; cis对照品中氯霉素内标的浓度（ g/L） ； DB51/T797-2008 4 c供试溶液中氯霉素浓度（ g/L） ； cis供试溶液中氯霉素内标的浓度（ g/L） ； A试样溶液中氯霉素的峰面积； Ais试样溶液中氯霉素内标的峰面积； X试料中氯霉素的残留量（ g/kg）; V溶解残
13、留物所用溶液体积（L） ； m组织样品的质量（kg） 5 检测方法灵敏度、准确度和精密度 5.1 灵敏度 氯霉素在鸡蛋中的检测限为 0.05g/kg，定量限为 0.2g/kg。 5.2 准确度 本方法在 0.2g/kg 1.0g/kg 添加浓度的回收率为 50%120%。 5.3 精密度 本方法的批内变异系数6% ，批间变异系数5% 。 DB51/T797-2008 5 附 录 A （资料性附录） 氯霉素特征离子质量色谱图、特征离子质谱图 std08Time1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00%81.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.0
14、0%71.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00%151.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00%3822-std1 MRM of 4 Channels ES- 326.3 157.23.35e33.40822-std1 MRM of 4 Channels ES- 321.3 257.38023.450.75 1.35 5.35822-std1 MRM of 4 Channels ES- 321.3 152.41.76e33.45822-std1 MRM of 4 Channels ES- TIC6.11e33.43图A.1 氯霉素标准溶液特
15、征离子质量色谱图 20070327m/z100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500%0100CAPD 238 (1.598) Cm (237:245) Daughters of 321ES- 4.03e6151.6150.5175.6158.6193.6320.7256.7248.6147.6126.5145.6117.7 218.7 320.0321.9272.5285.3413.1336.2400.7369.3 471.5462.0439.6490.4图 图 A.2
16、氯霉素特征离子质谱图 DB51/T797-2008 6 20070327m/z100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500%0100CAPD 125 (0.841) Cm (123:125) Daughters of 326ES- 4.44e6156.6155.5261.7179.6177.3125.9124.5198.6253.7151.4223.5325.8324.9297.7326.4262.2456.8 475.1488.1390.9382.1430.5402.6344.2图 图 A.3 氘代氯霉素特征离子质谱图
