1、 ICS:65.020.30 DB51B 45 备案号： 四川省地方标准DB51/T957 2009牦牛肉的鉴别 PCR 法 Method for the identification of yak PCR assaay 2009-06-02 发布 2009-06-10 实施四川省质量技术监督局发布DB51/T9572009 I 目 次 前言 . II 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 原理 1 4 试剂和溶液 . 1 5 仪器和设备 . 2 6 测定步骤 2 7 结果判定 3 DB/T 2008 II 前 言 本标准的附录A为资料性附录。 本标准按GB/T1.12000标准的结构和编
2、写规则和GB/T1.22002标准中规范性技术要素内容的确定方法要求进行编制。 本标准由四川省畜牧食品局提出并归口 本标准由四川省质量技术监督局批准 本标准由四川省畜产品安全监测中心、四川农业大学负责起草。 本标准起草人： 柏 凡、吴登俊、李 云、程传民、冯 娅。 DB51/T9572009 1 牦牛肉的鉴别 PCR 方法 1 范围 本标准规定了基于PCR法测定牦牛源性成分的方法。 本标准适用于食品加工（含加工制备的肉制品）中牦牛源性成分的测定，用于真假牦牛肉的鉴别。 本方法检出最低的牦牛源性成分含量为0.01%。 2 规范性引用文件 下列文件的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注明
3、日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括刊物的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T 6682-1992 分析试验使用水规则和试验方法 GB/T 1.1-2000 标准化工作导则第1 部分:标准的结构和编写规则 3 原理 针对牦牛肉的特殊性，在传统的蛋白酶P消化过夜和酚/氯仿抽提方法的基础上进行了一定改进，用改进后的方法提取样品中的总DNA后，首先加入18sDNA引物P CR扩增本标准内参基因18sDNA片段（137bp）并进行凝胶电泳检测，看所提取的总DNA是否具有有效
4、性。 如果能成功扩增出内参基因18sDNA片段，则认为所提取总DNA可以满足后面的测定要求。然后继续加入12srDNA引物扩增12srDNA片段（453bp），然后用只针对牦牛的特异性内切酶酶切12srDNA片段，酶切片断为 203bp和250bp，用凝胶电泳检测即可得出结论。 4 试剂和溶液 除特殊注明外，本法所用试剂均为分析纯。 水应符合GB/T 6682-1992 一级水规定。 4.1 氯仿。 4.2 异戊醇。 4.3 异丙醇。 4.4 无水乙醇。 4.5 Tris 碱。 4.6 硼酸。 4.7 Tris-饱和酚 未氧化（白色）。 4.8 二水乙二胺四乙酸二钠。 4.9 Mastermi
5、x。 4.10 Marker(100bp-600bp) 4.11 12S-rDNA、18S-rDNA 扩增引物，见表 1。 DB/T 2008 2 表1 内源参照基因 18SrDNA 和 12SrDNA 通用引物 引物 片段大小（bp） 引物 上：25bp 5-TCT GCC CTA TCA ACT TTC GAT GGT A-3 18S-rDNA 下：25bp 5-AAT TTG CGC GCC TGC TGC CTT CCT T-3 上：30bp 5-GCT TCA AAC TGG GAT TAG ATA CCC CAC TAT-3 12S-rDNA 下：28bp 5-TGA CTG CA
6、G AGG GTG ACG GGC GGT GTG T-3 4.12 蛋白酶 K：称取 20mg 蛋白酶 K 加入 1.5ml 的灭菌过的离心管，用微量移液器取 1ml 超纯水混匀，-20冰箱保存备用。 4.13 EDTA贮存液（0.5mol/L pH8.0）：在 800ml超纯水中加入 186.1g 二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2H 2O），在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节溶液PH至 8.0，然后定容至 1L，高压灭菌。 4.14 10TBE 缓冲液：Tris 碱 54g、硼酸 27.5g、0.5 mol/l EDTA（PH8.0）20ml，加超纯水至 500ml。 4.15
7、SDS（10%）：SDS 10g、加超纯水至 100ml，调节 PH 值到 7.2。 4.16 Tris-HCL（1mol/L）：在 800ml 超纯水中溶解 121.1gTris 碱，加入浓 HCL 调节 pH 至 8.3，再加入超纯水定容至 1000ml，分装后高压灭菌。 4.17 TE：1.0ml 1mol/L Tris-HCL、0.5mol/L pH8.0 EDTA 贮存液 0.2ml，加超纯水至 100ml 。 4.18 1.5%琼脂糖凝胶：称取 1.5g 琼脂糖放入锥形瓶，加入 10ml 10TBE,加超纯水定容至 100ml，在微波炉里加热熔解，待温度降到 60时加入 5l Go
8、ldview 摇匀。 4.19 1.5电泳缓冲液：10TBE 和超纯水按照 3：17 的比例混合摇匀。 5 仪器和设备 5.1 4冰冻离心机 5.2 单道可调移液器 2.5l-1000l 5.3 眼科剪 5.4 磁力搅拌器 5.5 PCR 仪 5.6 -20冰箱 5.7 锥形瓶 5.8 制胶板（带梳子） 5.9 电泳槽 5.10 调压电泳仪 6 测定步骤 6.1 DNA 提取 （1）取50mg待测样品（若为牛肉干制品应适量增加样品用量）放入事先加入350 l TE的EP管中，如样品为块状或颗粒较大，用眼科剪直接在管中剪碎，一个样品用一把眼科剪； （2）依次加入20mg/ml蛋白酶K 20 l、
9、10%SDS 30 l，55水浴12-16小时，间歇震荡，直至溶液澄清；加入等体积tris饱和酚，温和振荡10分钟，置于412000r/min离心10分钟； （3）小心吸取上清液，加等体积酚、氯仿、异戊醇体积比为25：24：1的混合液，温和振荡10分钟，412000r/min，离心10min； （4）取上清液，加等体积氯仿、异戊醇体积比为24：1的混合液，温和振荡1 0分钟，412000r/min，离心10min； （5）取上清液，加2倍体积的-20预冷的异丙醇，静止5分钟，412000r/min，离心10min； DB51/T9572009 3 （6）取沉淀，用70%乙醇清洗1次，41200
10、0r/min，离心5min； （7）取沉淀，干燥，加100 lTE溶液溶解。 6.2 总 DNA 有效性检测 加入18S-rDNA引物PCR扩增本标准内参基因18S-rDNA片段（137bp）。PCR反应在5 l体系中进行，其中18S-rDNA上、下游引物各0.15 l，Mastermix 2.5 l，超纯水1.7 l，DNA模板0.5 l。PCR反应条件为945min；9440s，6050s，7260s，循环35次；最后72延伸8min。扩增产物取4 l用1.5%琼脂糖凝胶、1.5电泳缓冲液电泳检测，用100-600bp DNA Marker作分子量标记。如有137bp的条带，则认为此总DN
11、A质量可以满后面测定的需要。 6.3 12S-rDNA 目的片段扩增及检测 加入12S-rDNA引物扩增12S-rDNA片段（453bp）。PCR反应在10 l体系中进行，其中12S-rDNA上、下游引物各0.3 l，Mastermix 5l，超纯水3.4 l，DNA模板1.0 l。PCR反应条件为945min；9440s，5950s，7260s，循环35次；最后72延伸8min。扩增产物取3 l用1.5%琼脂糖凝胶、1.5电泳缓冲液电泳检测，用100-600bp DNA Mark er作分子量标记。如有453bp的条带，则认为此扩增片段适合做进一步的内切酶酶切处理。 6.4 牦牛特异性内切酶
12、酶切 在剩下的7 l 12S-rDNA扩增产物中依次加入0.5 l BspH内切酶、2.5 l NEBuffer4，37温浴2小时。 6.5 酶切片段检测 用1.5%琼脂糖制成长度不小于4cm、厚度不小于0.4cm的凝胶，用100-600bp DNA Marker作分子量标记。取酶切产物5 l点样在80V电压、 1.5电泳缓冲液中电泳大约30分钟 （蓝色标记到整个胶长度的50%）后在紫外灯下观察是否有203bp和250bp的两条条带。 7 结果判定 若在紫外灯下能观察到203bp和250bp两条条带，则样品中含有牦牛源性成分，反之则没有。 若在紫外灯下观察到203bp和250bp两条条带，同时又能观察到453bp条带，则样品中混有其它牛源性成分。
