1、NORME I NTE R NAT1 O NALE IS0 10260 Premire dition 1992-07-1 5 Qualit de leau - Mesurage des paramtres biochimiques - Dosage spectrometrique de la chlorophylle a Wafer quality - Measurement of biochemical parameters - Spectrometric determination of the chlorophyll-a concentration Numro de rfrence IS
2、0 10260: 1992( F) IS0 10260:1992(F) Avant-propos LISO (Organisation internationale de normalisation) est une fdration tnon d i a I e d org a n i s m es n at ion aux de norm a I i sa t ion (corn it s m e m b res de IISO). Llaboration des Normes internationales est en gnral confie aux comits technique
3、s de IISO. Chaque comit membre int- ress par une tude a le droit de faire partie du comit technique cr cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec IISO participent galement aux tra- vaux. LISO collabore troitement avec la Commission lectrot
4、echnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation lectrotech- nique. . Les projets de Normes internationales adopts par les comits techni- ques sont soumis aux comits membres pour vote. Leur publication comme Normes internationales requiert lapprobation de 75 au moins des comits memb
5、res votants. La Norme internationale IS0 10260 a t labore par le comit techni- que ISO/TC 147, Qualit de leau, sous-comit SC 2, Mthodes physi- ques, chimiques et biochimiques. Les annexes A et B de la prsente Norme internationale sont donnes II n iq ueme nt a tit re din format ion. O IS0 1992 Droits
6、 de reproduction reserves. Aucune partie de cette publication ne peut tre repro- duite ni utilise sous quelque forme que ce soit et par aucun procd, lectronique ou mcanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans laccord crit de Iditeur. Organisation internationale de normalisation Case Pos
7、tale 56 CH-I211 Geneve 20 Suisse Imprim en Suisse ii IS0 10260:1992(F) Introduction La chlorophylle a est le principal pigment photosynthtique des algues vertes. La teneur en chlorophylle a des eaux de surface constitue un indicateur de leur tat trophique. Sa dtermination permet dvaluer la biomasse
8、et lactivit photosynthtique potentielle des algues. Les principaux produits de dgradation de la chlorophylle sont la phophytine et la phophorbid.e, et le rapport chlorophylle alphopigments est un indicateur de Itat physiologique des algues. iii NORME INTERNATIONALE IS0 10260:1992(F) Qualit de leau -
9、 Mesurage des paramtres biochimiques - Dosage spectromtrique de la chlorophylle a 1 Domaine dapplication 1.1 La prsente Norme internationale prescrit une mthode de dosage de la chlorophylle a. Elle est applicable Ivaluation du phytoplancton dans les eaux de surface naturelles et aux essais biologiqu
10、es portant sur la croissance algale. condition dutiliser des mthodes dchantillon- nage appropries, elle peut galement tre appli- que aux communauts phytobenthiques (voir annexe A). 1.2 Les autres pigments tels que les chlorophylles b et c et certains des produits de dgradation de la chlorophylle nin
11、terviennent pas dans le dosage. II est possible deffectuer une analyse semi- quantitative des phopigments afin de tenir compte de leur interfrence dans le dosage de la chlorophylle a et dvaluer la proportion de biomasse algale inactive. 1.3 La chlorophylle est sensible laction de la lumire et de lox
12、ygne, notamment au moment de lextraction. Pour empcher sa dgradation par oxydation ou photoraction, il faut viter toute ex- position la lumire des chantillons et tout contact avec lair. Lhomognisation de Ichantillon per- met dans certains cas daccrotre le rendement dextraction. 1.4 Si lextraction es
13、t effectue Ithanol, il faut chauffer 75 OC pendant 5 min afin dinactiver la chlorophyllase et dacclrer la lyse des pigments. Le temps entre lextraction et le mesurage doit etre bref, mais il est possible de conserver les extraits (mais non les filtres) au rfrigkrateur (4 OC), pendant 3 jours au maxi
14、mum, ou temprature infrieure - 25 OC pendant au moins 30 jours. 1.5 Bien que le mode opratoire comprenne une tape de filtration ou centrifugation destine la clarification de lextrait final, il peut subsister une lgre turbidit. Lacidification, Bgalement, peut en- traner une certaine turbidit. II faut
15、 donc soustraire de la valeur de Iabsorbance 665 nm une correc- tion de turbidit6gale a Iabsorbance 750 nm. 1.6 Le pigment - de certaines bactries phototrophes peu courantes (Chlorobium par exem- ple) interfre dans le dosage de la chlorophylle a I. Par contre, la contribution des chlorophylles b et
16、c Iabsorbance a 665 nm est ngligeable 2. 2 Rfrences normatives Les normes suivantes contiennent des dispositions qui, par suite de la rference qui en est faite, constituent des dispositions valables pour la pr- sente Norme internationale. Au moment de la pu- blication, les ditions indiques taient en
17、 vigueur. Toute norme est sujette rvision et les parties prenantes des accords fonds sur la prsente Norme internationale sont invites rechercher la possibilit dappliquer les ditions les plus rcentes des normes indiques ci-aprs. Les membres de la CE1 et de IISO possdent le registre des Normes interna
18、tionales en vigueur un moment donn. IS0 5667-1:1980, Qualit de leau - chantillonnage - Partie 1: Guide gnral pour Itablissement des programmes dchantillonnage. IS0 5667-2:1991, Qualit de leau - khantillonnage - Partie 2: Guide gnral sur les techniques dchantillonnage. 3 Principe Filtration dun chant
19、illon deau pour isoler les al- gues et autres matires en suspension. partir du rsidu de filtration, extraction des pigments Ithanol chaud. Dosage spectromtrique de la chlorophylle a contenue dans lextrait. Evaluation de la concentration de la chlorophylle a et des phkopigments daprks la diffrence da
20、bsorbance a 1 IS0 10260:1992(F) 665 nm avant et aprs acidification de lextrait a, 41. 4 Ractifs Utiliser uniquement des ractifs de qualit analyti- que reconnue et de leau dsionise ou de puret q u iva le nte. 4.1 Acide chlorydrique, c(HCI) = 3 mol/l. 4.2 Ethanol, C,H,OH, en solution aqueuse 90 Y0 (Vj
21、v). NOTE 1 En rgle gnrale, la prsence dun dnaturant dans Ithanol ninterfre pas dans le dosage. II est tou- tefois recommand de procder un dosage comparatif avec de Ithanol pur (90 %) lors de la rception de tout lot inconnu 4. 5 Appareillage Matriel courant de laboratoire, et 5.1 Spectromtre, permett
22、ant de mesurer Iabsor- bance dans le domaine visible, jusqu 750 nm, avec une rsolution de 1 nm, une largeur de bande inf- rieure ou gale 2 nm, et une sensibilit infrieure ou gale 0,001 unit dabsorbance, muni de cuves de parcours optique compris entre 1 cm et 5 cm. 5.2 Dispositif de filtration sous v
23、ide, support et pince de fixation. 5.3 Filtres en fibre de verre sans liant organique, destins la filtration des chantillons deau, rete- nant plus de 99 Y. des particules de diamtre sup- rieur 1 pm, et de diamtre compris entre 25 mm et 50 mm. 5.4 Filtres destins a la filtration des extraits, pr- sen
24、tant les mmes caractristiques que les filtres dcrits en 5.3, mais de diamtre infrieur, par exemple 25 mm, ou Centrifugeuse, avec acclration de 6 O00 g et rotor pouvant recevoir les tubes extraction spcifis. 5.5 Bain deau, pouvant tre maintenu 75 OC f 1 OC, avec support destin recevoir les tubes extr
25、action. 5.6 Tubes A extraction, par exemple en verre ambr col large et capuchon vis revtu de polyttrafluorthylne (PTFE), capacit 30 ml 50 ml, utilisables pour la centrifugation a 6 O00 g. 6 chantillonnage et conservation des chantillons Lchantillonnage doit tre conduit comme spcifi dans IISO 5667-1
26、et IISO 5667-2. La conservation des chantillons deau au rfrigrateur ( lobscurit et pendant moins de 8 h) est admise, mais il est prfrable. si possible, de procder aux oprations 7.1 7.3 immdiatement aprs Ichantillonnage. Les extraits bruts peuvent tre conservs temp- rature infrieure - 25 OC, pendant
27、au moins 30 jours, dans des tubes a extraction en verre brun (5.5) hermtiquement ferms. Les chantillons et les filtres, par contre, ne doivent pas tre congels. 7 Mode opratoire 7.1 Filtration Agiter les chantillons pour bien les homogniser. Filtrer un volume dchantillon V, (gnralement compris entre
28、0,l litre et 2 litres, suivant la teneur en algues) travers un filtre en fibre de verre (5.3) fix sur un support adquat avec une pince. Scher le filtre sous vide. le sparer de son support et le placer dans le tube extraction. Sil entre dif- ficilement dans le tube, le dcouper en morceaux. hiter tout
29、 contact avec les doigts. 7.2 Variante dextraction A Chauffer 75 OC le volume requis dthanol (4.2) Verser un petit volume dthanol chaud (gn- ralement 30 ml 40 ml) dans le tube contenant les morceaux de filtre. Laisser refroidir quelques minu- tes, puis dchiqueter le filtre, de prfrence avec une bagu
30、ette de broyage de tissus, pour faciliter lextraction. Laver la baguette avec un peu dthanol (4.2) pour entraner les particules adhrentes. Pro- cder lextraction pendant au moins 3 min. NOTE 2 En rgle gnrale, lextraction est conduite temprature ambiante pendant plusieurs heures ou toute une nuit. Si
31、elle est prolonge, ou si lextrait doit tre conserv pendant plusieurs jours (par exemple un week- end), il convient de placer les tubes extraction au rfri- grateur. Transfrer la suspension, au travers dun filtre (5.4), dans une fiole jauge avec bouchon (capacit 50 ml ou 100 ml). Laver le tube extract
32、ion avec de Ithanol (4.2) pour entraner lextrait rsiduel et transfrer quantitativement le produit de lavage dans la fiole jauge, en rincant le filtre. Complter au trait, boucher et bien homogniser. Le volume obtenu est le volume dextrait V,. 2 IS0 10260:1992(F) Procder ensuite comme dcrit en 7.4. 7.
33、3 Variante dextraction B Mesurer exactement un volume VE dthanol (4.2) (gnralement 20 ml ou 25 ml), le placer dans le tube extraction (5.6) et y plonger les morceaux de filtre. Visser hermtiquement le capuchon sur le tube pour viter les pertes de solvant par vapo- ration. Agiter doucement pour remet
34、tre le rsidu de filtration en suspension. Placer le tube dans le bain deau (5.5), de facon que le niveau de lextrait soit align avec le niveau de leau du bain. Chauffer pendant 5 min, en agitant doucement vers la fin. Sortir les tubes extraction du bain deau et les laisser refroidir pendant 15 min t
35、emprature am- biante. Mesurer lextrait, si possible, immdiatement. NOTE 3 A ce stade, lextrait peut tre conserv au r- frigdrateur pendant toute une nuit, avant lanalyse (voir 7.4). La dure de stockage ne doit pas dpasser 3 jours. Transfrer le surnageant, au travers dun filtre (5.4), dans une fiole p
36、ropre (5.6), mais sans rincer avec du solvant frais (voir note 4). Il est galement possible de centrifuger lextrait contenu dans les tubes extraction jusqu lobten- tion dun surnageant clair. Le dosage photomtrique doit tre realis sur un extrait ou un surnageant limpide. NOTE 4 Lorsque lon utilise ce
37、tte mthode, il suffit de rcuprer une partie de lextrait puisque le volume initial de solvant utilis, V, est exactement connu et reste constant, la fermeture hermtique des tubes empchant les pertes par vaporation. Par ailleurs, la teneur en eau rsiduelle des filtres (voir 7.1), qui reprsente moins de
38、 5 O/O du volume de lextrait, est ngligeable. 7.4 Dosage photometrique 7.4.1 Transfrer la pipette une partie de lextrait clair dans la cuve du spectromtre, en laissant un volume libre suffisant pour ltape dacidification (voir 7.4.2). Mesurer Iabsorbance 665 nm ( est le volume dextrait, en millilitre
39、s; est le volume dchantillon filtr, en litres; est la valeur oprationnelle du coefficient dabsorption spectral spcifique de la chlorophylle a (extraite du document 21); est le rapport A/A, pour une solution de chlorophylle a pure transforme en phophytine par acidification (voir 7.4.2) (valeur extrai
40、te du document 2); est le parcours optique de la cuve, en centimtres; est un facteur dimensionnel sappliquant Ve. - 7.4.1); 8.2 La concentration pp des phopigments, en mi- crogrammes par litre, se calcule daprs Iquation suivante: 8.3 Si lon prend 82 comme valeur du coefficient dabsorption spectral S
41、pcifique de la chlorophylle a dans Ithanol 90 Yo, et 1,7 coinme valeur du coefficient dacidification maximal (R), labli pour la chlorophylle a pure, la concentration de chlorophylle 3 IS0 10260:1992(F) - - I n na X Ur vc I OR Y0 rdl PSil Y0 rd1 chantillon A 18 71 O 126,5 5,46 4,3 6,36 B 18 70 2,8 20
42、,3 3,67 18,l 2,QO C 17 67 5,6 24,6 2,21 9,o 2,8 a pc dans Ichantillon deau peut se calculer plus simplement par Iquation . . . (3) ve pc = (A - A,) x 29,6 x - V;d VCR % 5,o 11,3 11,4 - et la concentration des phopigments, par Iqua- tion (4) NOTES 6 Les concentrations ainsi calcules sont moins fiable
43、s pour les phopigments que pour la chlorophylle a. Un es- sai circulaire a mis en vidence une variabilit interlabo- ratoire de lordre de 5 ?40 11 ?h pour la chlorophylle a et de 6 % 46 % pour les phopigments. 7 Le rapport A/A, est gal 1,7 si Ichantillon ne contient pas de chlorophylle dgrade, et 1 s
44、il contient exclusivement des produits dgrads de la chlorophylle U. La valeur oprationnelle du coefficient dabsorption sp- cifique de la chlorophylle a dans Ithanol (4.2), 82, a t dtermine partir de la valeur oprationnelle recom- mande dans le document 5 665 nm. Cette valeur (84), tient compte de la
45、 prsence des chlorophylles b et c, et Iabsorbance de la chlorophylle a 665 nm est, concentration gale, de 2 % 3 YO plus leve dans lactone que dans Ithanol (4.2) 2, 4. 8.4 Noter les rsultats, en niicrogrammes par litre (ou en milligrammes par mtre cube), avec, au plus, deux chiffres significatifs ou
46、un chiffre aprs la vir- gule. Exemples: Concentration de chlorophylle a Concentration de phopigments 5,5 pg/l 0,l pg/l 9 Fidlit Un essai interlaboratoire, conduit en 1983, a fourni les rsultats donns au tableau 1 SI. 10 Rapport dessai Le rapport dessai doit contenir les informations suivantes: a) rf
47、rence la prsente Norme internationale; b) identification de Ichantillon deau; c) expression des rsultats comme spcifi dans larticle 8; d) ventuellement, pr-traitement appliqu Ichantillon; e) tout cart par rapport au mode opratoire spci- fi ou tout incident susceptible davoir agi sur les - rsultats. Tableau 1 - Rsultats de fidlit _ I est le nombre de laboratoires participants n est le nombre de valeurs obtenues n, est le
