1、NORME INTERNATIONALE ISO 13685. Premire dition 1997-08-I 5 Gingembre et olorsines de gingembre - Dosage des principaux composs piquants (gingrols et shogaols) - Mthode par chromatographie en phase liquide haute performance Ginger and its oleoresins - Determination of the main pungent components (gin
2、gerols and shogaols) - Method using high-performance liquid chromatography Numro de rfrence ISO 13685: 1997(F) ISO 13685: 1997(F) Avant-propos LISO (Organisation internationale de normalisation) est une fdration mondiale dorganismes nationaux de normalisation (comits membres de IISO). Llaboration de
3、s Normes internationales est en gnral confie aux comits techniques de IIISO. Chaque comit membre intress par une tude a le droit de faire partie du comit technique cr cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec IISO participent galement aux
4、 travaux. LISO collabore troitement avec la Commission lectrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation lectrotechnique. Les projets de Normes internationales adopts par les comits techniques sont soumis aux comits membres pour vote. Leur publication comme Normes internationa
5、les requiert lapprobation de 75 % au moins des comits membres votants. La Norme internationale ISO 13685 a t labore par le comit technique ISO/TC 34, Produits agricoles alimentaires, sous-comit SC 7, Epices. Les annexes A E de la prsente Norme internationale sont donnes uniquement titre dinformation
6、. 0 ISO 1997 Droits de reproduction rservs. Sauf prescription diffrente, aucune partie de cette publication ne peut tre reproduite ni utilise forme que ce soit et par aucun procd, lectroniq sous quelque ue ou mcanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans laccord crit de lditeur. Organisa
7、tion internationale de normalisation Case postale 56 l CH-121 1 Genve 20 l Suisse Internet central iso.ch x.400 c=ch; a=400net; p=iso; o=isocs; s=central Imprim en Suisse ii 0 ISO ISO 13685: 1997(F) Introduction La prsente mthode, initialement base sur les publications de Wood de lOverseas Developme
8、nt Natural Resources Institute (ODNRI) lve toute ambigut sur lidentit des pics obtenus par CLHP, retenus pour les contrles de qualit des extraits de gingembre. Elle se justifie particulirement dans ce cas o les composs organoleptiquement intressants sont trs thermosensibles. La mthode a t valide par
9、 deux essais interlaboratoires raliss sur le plan international par sept laboratoires. Aprs examen des rsultats, il a t estim que la mthode pouvait tre considre comme constituant ltat de lart actuel, mais quelle pourrait certainement tre amliore, notamment en ce qui concerne les donnes de fidlit. Pa
10、ge blanche NORME INTERNATIONALE o ISO ISO 13685: 1997(F) Gingembre et olorsines de gingembre - Dosage des principaux composs piquants (gingrols et shogaols) - Mthode par chromatographie en phase liquide haute performance 1 Domaine dapplication La prsente Norme internationale dcrit une mthode pour la
11、 dtermination des gingrols 63-G, 81-G et 101-G et des shogaols correspondants 63-S, 81-S et lO-S dans le gingembre sch ou dans les olorsines de gingembre, par chromatographie liquide haute performance en phase inverse. NOTE - La structure chimique des gingrols et shogaols sont donnes en annexe A. 2
12、Rfrences normatives Les normes suivantes contiennent des dispositions qui, par suite de la rfrence qui en est faite, constituent des dispositions valables pour la prsente Norme internationale. Au moment de la publication, les ditions indiques taient en vigueur. Toute norme est sujette rvision et les
13、 parties prenantes des accords fonds sur la prsente Norme internationale sont invites rechercher la possibilit dappliquer les ditions les plus rcentes des normes indiques ci-aprs. Les membres de la CEI et de IISO possdent le registre des Normes internationales en vigueur un moment donn. ISO 939:1980
14、, Epices - Dtermination de la teneur en eau - Mthode par entralnement. ISO 2825:1981, pices - Prparation dun chantillon moulu en vue de Kanalyse. 3 Principe partir de gingembre pulvris et sch, extraction au mthanol des composs piquants, temprature ambiante et concentration sous pression rduite dune
15、partie de lextrait. Les olorsines sont dissoutes dans le mthanol. Les solutions rsultantes sont analyses directement (sans aucune purification pralable) par chromatographie liquide haute performance (CLHP) en phase inverse sur une colonne remplie doctadcylsilyl silice, avec comme phase mobile un mla
16、nge dactonitrile et dacide actique aqueux et par dtection UV 280 nm. La quantification est ralise en utilisant un talon externe avec lacide nonanoque vanillylamide qui a un temps de rtention comparable celui du 6-gingrol (ainsi quun spectre dabsorption UV comparable). ISO 13685:1997(F) 0 ISO 4 Racti
17、fs et produits Sauf indication diffrente, utiliser uniquement des ractifs de qualit analytique reconnue et de leau de qualit CLHP. 4.1 talon externe: acide nonanoque vanillylamide (NVA), dont le point de fusion se situe entre 42 OC et 44 OC, donnant essentiellement un pic unique (au moins 98 % de la
18、ire totale du pic entre 3 min et 8 min) en analyse par CLHP dans les conditions dcrites dans la prsente Norme internationale. AVERTISSEMENT - Le NVA est un produit qui peut causer des irritations. NOTE - Le NVA est aussi connu sous lappellation ou . 4.2 Solvants AVERTISSEMENT - Lactonitrile est un p
19、roduit toxique qui doit tre utilis avec prcaution. Des tudes sont en cours pour le remplacer ultrieurement par un autre produit. 4.2.1 Mthanol, de qualit CLHP, pour la prparation de ltalon NVA. 4.2.2 Mthanol, de qualit analytique, pour la dilution et lextraction des chantillons pour essai. 4.2.3 Act
20、onitrile, de qualit CLHP. 4.2.4 Acide actique cristallisable. 5 Appareillage Matriel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit. 5.1 Chromatographe Appareil quip pour lanalyse par CLHP avec: - un systme dinjection capable de dlivrer des portions aliquotes de 20 ul de la solution dchantil
21、lon avec une grande prcision; - un dtecteur ultraviolet (UV) rgl pour mesurer Iabsorbance une longueur donde de 280 nm; - un enregistreur/intgrateur capable de mesurer laire des pics, avec correction de ligne de base approprie, ayant une sensibilit de 0,25 0,5 a.u.f.s. 5.2 Colonne en acier inoxydabl
22、e, de 250 mm de longueur et de 4,6 mm de diamtre (ou de dimensions comparables) remplie dune phase stationnaire de type Cl, avec des particules de 5 um l). 5.3 vaporateur rotatif sous vide, quip dun bain deau contrl thermostatiquement. 5.4 Appareil filtration sous vide. 5.5 Filtres Millipore type FH
23、 2, , avec pores de 0,5 um, pour solvants organiques. 1) ODS-2, distribu par Phase Separations Ltd., GB, est un exemple de produit appropri disponible sur le march. Cette information est donne a lintention des utilisateurs de la prsente Norme internationale et ne signifie nullement que IISO approuve
24、 ou recommande lemploi exclusif du produit ainsi dsign. 2) Les filtres Millipore sont des exemples de produits appropris disponibles sur le march. Cette information est donne a lintention des utilisateurs de la prsente Norme internationale et ne signifie nullement que IISO approuve ou recommande lem
25、ploi exclusif des produits ainsi dsigns. 2 0 ISO ISO 13685: 1997(F) 5.6 Filtres Millipore type HA 2), avec pores de 0,45 um, pour solvants aqueux. 5.7 Pipettes deux traits, de classe A, de 20 ml de capacit. 5.8 Pipette Pasteur. 5.9 Fioles jauges un trait, de 5 ml, 25 ml et 100 ml de capacits. 5.10 B
26、allon fond rond, de 100 ml de capacit. 5.11 Balance analytique, prcise + 0,001 g prs. 6 Prparation de lchantillon pour essai 6.1 Gingembre sch Sauf sil est dj sous forme de poudre fine, le gingembre sch doit tre moulu comme dcrit dans IISO 2825 pour pouvoir passer au travers dun tamis de 1 mm douver
27、ture de maille. La teneur en eau du produit moulu doit tre dtermine conformment IISO 939. 6.2 Olorsines de gingembre Bien agiter et homogniser Iolorsine avant de prlever les chantillons pour essai. 7 Mode opratoire 7.1 Prparation des solutions talons de NVA Peser, 0,001 g prs, 0,l g de NVA (4.1), le
28、 dissoudre dans du mthanol (4.2.1). Complter la solution 100 ml. Conserver cette solution ( environ 1,O mg/ml) - 10 OC et, sil y a lieu, prparer les solutions talons ( environ 0,2 mg/ml et 0,4 mg/ml) en diluant la solution initiale (5 ml et 10 ml respectivement, dilus 25 ml) avec du mthanol (4.2.1).
29、 Noter les concentrations exactes. 7.2 Prparation des solutions chantillons de NVA 7.2.1 Gingembre sch Dans une fiole jauge de 100 ml (5.9), peser, 0,001 g prs, 1 g de gingembre moulu. Complter au trait repre avec du mthanol (4.2.2). Boucher la fiole et lagiter vigoureusement. Aprs 2 h, agiter de no
30、uveau vigoureusement, puis laisser reposer au moins 12 h. laide dune pipette (5.7) et sans toucher le dpt au fond de la fiole, prlever une portion aliquote de 20,O ml de la solution surnageante. La placer dans un ballon fond rond de 100 ml (5.10) et rduire le volume de solvant environ 2 ml laide de
31、lvaporateur rotatif sous vide (5.3). II convient que la temprature du bain deau ne dpasse pas 40 OC. laide dune pipette Pasteur (5.8), transfrer la solution concentre et le mthanol de rinage dans une fiole jauge de 5 ml (5.9) et complter au trait repre avec du mthanol (4.2.2). Boucher la fiole et la
32、giter vigoureusement. Mettre de ct les deux extraits le non concentr (original) et le concentr pour les analyses en CLHP. Pour chaque chantillon, prparer ces extraits en double et noter les concentrations exactes en milligrammes par millilitre. 7.2.2 Olorsines de gingembre Peser, 0,001 g prs, 0,5 g
33、dolorsine dans une fiole jauge de 100 ml (5.9) et noter la masse exacte. Complter au trait repre avec du mthanol (4.2.2), boucher et agiter vigoureusement. Pour chaque chantillon dolorsine, prparer ces solutions en double et noter les concentrations exactes en milligrammes par millilitre. ISO 13685:
34、 1997(F) 0 ISO 7.3 Chromatographie 7.3.1 Phase mobile actonitrile avec de leau contenant 1 % dacide actique (65:35 avant dgazage) Au moyen de lappareil filtration sous vide (5.4), faire passer 520 ml dactonitrile (4.2.3) travers un filtre Millipore type FH (5.5). Mlanger de leau et de lacide actique
35、 cristallisable (4.2.4) dans les proportions 99:l (WV) et faire passer 280 ml de ce mlange sur un filtre Millipore type HA (5.6) dans la solution dactonitrile filtre. Dgazer le mlange en le gardant sous pression rduite (environ 0,3 bar), avec agitation magntique pendant 5 min, ou par tout autre moye
36、n convenable. Transfrer la phase mobile dans le rservoir du chromatographe et tablir un dbit de 1,O ml/min. 7.3.2 Dtermination des facteurs de rponse Rgler IenregistreurYintgrateur (5.1) pour empcher lintgration jusqu ce que les perturbations de la ligne de base dues au passage du solvant dinjection
37、 travers le dtecteur aient cess (gnralement environ 3 min partir de linjection). Ajuster le dtecteur et/ou lenregistreur la sensibilit approprie. Faire des injections rptes de 20 ul de chacune des solutions talons de NVA (7.1) en laissant pour chaque chromatogramme un temps de droulement gal au temp
38、s de rtention du NVA (gnralement 4 min 5 min) plus 4 min. Injecter chaque solution talon au moins trois fois. Noter laire du pic du NVA pour chaque chromatogramme et calculer la valeur moyenne pour chaque concentration de NVA (environ 0,2 mg/ml et 0,4 mg/ml). Calculer le facteur de rponse, K, , pour
39、 le NVA comme suit: KNVA = CNVA X 100 ANVA mg/100 mI/unit daire 3, O cNVA est la concentration de NVA, en milligrammes par millilitre; ANVA est laire moyenne du pic de NVA cette concentration. Pour une rponse linaire, les valeurs de KNVA calcules pour les deux concentrations ne doivent pas diffrer d
40、e plus de 2 %. Voir la courbe dtalonnage en annexe C. Calculer ensuite les valeurs de Kpour chaque gingrol et shogaol, comme indiqu ci-dessous. Pour le 6-gingrol: K 294,38 PI-G = KNvA x 293 9 = KNVA x 1,003 mg/100 mI/unit daire O 294,38 est la masse molculaire du 6-gingrol; 293,41 est la masse molcu
41、laire du NVA. 3) Unit propre lintgrateur utilis. Cette unit arbitraire est limine au cours du calcul. 4 0 ISO ISO 13685: 1997(F) De la mme faon, K PI-G = KNvA x 1,099 mg/1 00 mknit daire KlOfG = KNVA x 1 ,194 mg/1 00 ml/unit daire K W = KNVA x 0,942 mg/100 ml/unit daire K PIS = KNVA x 0,942 mg/100 m
42、I/unit daire qlo)s = KNVA x 1 ,133 mg/100 mI/unit daire 7.3.3 Analyse des solutions chantillons 7.3.3.1 Gingembre sch Injecter chaque extrait concentr prpar en 7.2.1, en utilisant les mmes rglages instrumentaux quen 7.3.2, mais en respectant un temps de droulement plus long denviron 17 min. Enregist
43、rer les aires des pics correspondants aux 61-G, 81-G, 61-S et 101-G rpertoris dans lordre des temps de rtention. (Voir le chromatogramme type en annexe D.) Les composs 81-S et lO-S sont rarement trouvs en quantits significatives dans le gingembre sch et le pic du 61-G, dont le temps de rtention est
44、proche de celui du NVA, est normalement le plus grand sur le chromatogramme. Pour un chantillon dont lextrait concentr conduit une aire de pic pour le 61-G plus grande que celle du pic du NVA dans ltalon 0,4 mg/ml, injecter aussi lextrait non concentr issu de 7.2.1 et utiliser le chromatogramme qui
45、en rsulte pour la dtermination de 61-G. 7.3.3.2 Olorsines de gingembre Injecter chaque solution dolorsine prpare en 7.2.2, en utilisant les mmes rglages instrumentaux quen 7.3.2, mais en respectant un temps de droulement plus long denviron 40 min. Enregistrer les aires des pics correspondants aux 61
46、-G, 81-G, 61-S, 101-G, 81-S, et lO-S rpertoris dans lordre des temps de rtention. (Voir le chromatogramme type en annexe D.) Les pics de 61-G et 61-S sont normalement les plus grands sur le chromatogramme et le temps de rtention de 61-G est voisin de celui du NVA. Pour un chantillon donnant une aire
47、 du pic pour 61-G plus grande que celle du pic du NVA dans ltalon 0,4 mg/ml, prparer et injecter une dilution approprie et utiliser le chromatogramme qui en rsulte pour la dtermination de 61-G. 8 Expression des rsultats Calculer la concentration de chaque gingrol ou shogaol dans lchantillon de gingembre sch ou dolorsine, comme illustr ci-dessous pour le 6-gingrol. La teneur en 61-G de lchantillon est 9) 6GXK P)G C % (mn) A 6)G est laire du pic de 61-G sur le chromatogramme de lchantillon (dtermin en 7.3.3); 5 ISO 13685: 1997(F
