1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖犜植物病毒检测规范犖狅狉犿犳狅狉犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅狀狆犾犪狀狋狏犻狉狌狊犲狊发布实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布版权所有 禁止翻制、电子发售书书书前言本标准按照给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国云南出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人：郑耘、陈枝楠、李明福、娄定风、李芳荣、丁元明、邓丛良。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售植物病毒检测规范范围本标准规定了取样、运输和接收、检测人员、仪
2、器设备、药品试剂、检测方法、样品、毒源的制备与保存等方面的要求和规范。本标准适用于进出境植物及其产品中病毒的检疫鉴定。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。实验室质量控制规范植物检疫基因检验实验室技术要求植物病毒免疫电镜检测方法进出境植物及植物产品检疫抽样术语和定义下列术语和定义适用于本文件。植物病毒狆犾犪狀狋狏犻狉狌狊一类由核酸和蛋白质外壳组成的具有侵染活性的细胞内寄生病原物。症状狊狔犿狆狋狅犿植物受病原物或不良环境因素的侵扰后，内部的生理活动、外观和生长发育所
3、显示的某种异常状态。鉴别寄主犱犻犳犳犲狉犲狀狋犻犪犾犺狅狊狋用来鉴别病毒或病毒株系的植物，所产生的特征性症状可用来区分植物上常见的病毒。取样狊犪犿狆犾犻狀犵用一定的方法从大批物料中取出少量有代表性物料的过程。隔离检疫犻狊狅犾犪狋犲犱狇狌犪狉犪狀狋犻狀犲是国家植物检疫机关按照有关检疫规定，在指定的场所对进出境植物种子、苗木及其他繁殖材料，实施隔离试种、观察、检疫和处理的过程。空白对照犫犾犪狀犽不给予任何处理的对照。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售阴性对照狀犲犵犪狋犻狏犲犮狅狀狋狉狅犾从健康植物或其产品样品中制备的不含有目标病毒的样品。阳性对照狆狅狊犻狋犻狏犲犮狅狀狋狉狅犾从标准病毒毒源中提取的
4、含有目标病毒的样品。同源性犺狅犿狅犾狅犵狔两个病毒基因片段的核苷酸序列间的相似程度。检测人员需具备的条件和素质要求按照中人员的要求执行。取样及接收样品取样取样计划根据样品的特性和样品中可能存在的病毒表现出的症状特点，确定取样方法、取样数量、取样工具、保存方法等。对实验室检测发现疑似病毒，但还不能做出准确判定，需要更多样品进行确认时，需重新制定更为合适的取样计划，进行再次取样。现场取样取样人员根据相关标准有针对性地对样品进行检查和取样，并填写相关记录单（包括采样时间、数量、采样人、采样标准等信息）。取样按照的规定执行。传递与运输样品应放在耐受性好、密闭、防渗漏、具有防交叉污染的样品袋中。在样品袋
5、外部要贴有标签（表明样品编号、货物名称、取样部门、取样时间等信息）。对需要低温保存和运输的样品应采取必要措施。保证样品在传递过程中能够保持原有形态，防止可能含有的有害生物逃逸、扩散，确保样品真实、安全、及时传递到实验室。随检样品应附有送检单，送检单应与样品分开放置。运输样品的车辆应进行定期的消毒处理。接收样品核对样品与送检单，检查包装及样品的完好情况，有无污染，对不符合要求的应重新取样。仪器设备和设施设备的配置应能满足隔离检疫、实验室检测和毒源保存等的工作要求。建立设备的确认、维护和校准等管理程序，以保证设备符合预期使用要求。计量器具应有检定合格标识。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售大型和关
6、键设备应有使用、维护和校准记录。有故障或者停用的设备应有明显的标识，以防止误用。应制定植物病毒检测过程中的关键设备发生故障时的应急预案，应急措施应不影响检测质量。植物病毒检测的主要设施和设备包括：足够开展植物病毒检测的实验室、隔离检疫温（网）室、微量榨汁机、酶标仪、仪、定量仪、序列测定仪、超（高）速冷冻离心机、台式冷冻离心机、高压灭菌锅、计、天平、紫外分光光度计、冰箱、恒温培养箱等。药品试剂建立和实施植物病毒检测药品试剂管理程序。包括药品试剂的评估、选购、确认、保存、使用、监控以及库存管理。药品试剂储存期间，应定期对药品试剂的灵敏度、特异性和稳定性进行比对试验，给出评价结果。隔离检疫制定隔离检
7、疫计划对每一批隔离植物制定一份书面的隔离检疫计划明确种植时间、地点、栽培管理要点和生长期检疫办法。该计划由专职检疫员制定，隔离检疫场负责人审核同意后执行。隔离检疫计划至少包括以下内容：）隔离种植物来源及相关背景；）隔离种植数量；）隔离检疫期限：隔离种植物的隔离检疫期限按审批规定执行。审批意见不明确的，一年生植物隔离检疫一个生长周期；多年生植物一般不少于年；因特殊原因，在规定时间内未得出检疫结果的，可适当延长隔离检疫时间；）隔离检疫方案设计：根据不同的植物，提供适宜的隔离检疫场地，确定具体地点和布局规划，并对隔离方式、管理要点、定期观察、取样检验、重点观察的有害生物种类和观察记载要点、发生检疫性
8、有害生物时的处理等进行详细设计。隔离检疫期栽培管理隔离检疫的种植要求同一批次的隔离种植物按照（隔离检疫计划）集中种植，不同批次的隔离种植物应相互隔离，以防止互相污染。种植前设施的处理隔离设施、介质、盆钵及专用器械应预先进行灭菌处理。栽培管理措施根据货主提供的植物栽培管理资料，采用适当的栽培管理措施。环境条件数据的采集隔离种植样品进入隔离检疫场地后，应记录隔离检疫环境的温度、空气湿度数据，有特殊要求的样品同时记载其他数据。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售隔离植物生长管理和记录管理人员负责隔离种植物生长期管理，定时记录生长状况，填写隔离检疫情况记录。隔离检疫期症状观察管理人员定期观察隔离种植生长
9、情况，发现植株出现异常现象应立即报告专职检疫人员。专职检疫人员根据需要定期观察隔离种植物有害生物发生情况，发现可疑植株应立即挂牌，并进行详细记录和准确描述；发现可疑的检疫性有害生物，应立即取样送室内检验。实验室病毒检测方法总则根据不同实验室检测能力、待检测病毒的特性和样品的不同情况（新鲜叶片或休眠种子），先选择一种方法检测，再通过另一种方法检测，将两种方法的检测结果互相验证，确定检测结果的准确性。所选用检测方法的技术资料应是国际标准、国家标准、行业标准或是公开发表的检测方法，并且这些方法都应经过特异性、再现性、灵敏度测试。鉴别寄主鉴定种质要求使用的鉴别寄主具有可溯源性。鉴别寄主种子的中文学名、
10、拉丁学名、产地、收集人、种子品种或品系和保存条件等信息均有记录。材料和栽培要求各种器具和栽培介质（如：种植铲、栽培盆、土壤等），经灭菌处理后方可使用，并有处理过程记录。所有试验用品在试验结束后，应做消毒、灭菌处理。收集使用过的鉴别寄主应集中销毁，并有处理过程记录。鉴别寄主的种植每次检测种植鉴别寄主数量至少株。种子播种于经过消毒的富含有机质土壤的花盆中，出苗后移栽到苗盘或花盆中，长至第片真叶完全展开后接种。栽植的环境条件通常控制在：温度为，光照为。接种每个样品至少接种株鉴别寄主，每株鉴别寄主接种两片以上叶片。每次检测均设空白对照。管理将鉴别寄主栽培于隔离检疫温（网）室中，逐日观察记录鉴别寄主症状
11、。记录接种病毒后定期观察，记录待测目标病毒的学名和中文名、鉴别寄主谱症状（注明时间）、接种方法、栽培温度、光照条件及采用的隔离控制措施等。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售结果判定根据鉴别寄主症状，确定是否携带病毒。在所有接种的鉴别寄主中只要有一株表现典型症状，则判定该样品带有病毒。血清学检测方法概述血清学检测方法是利用抗原抗体的体外特异性结合检测植物病毒，具有良好的灵敏度、特异性、重复性，主要包括酶联免疫吸附（）、免疫电镜（）、快速免疫滤纸法等。酶联免疫吸附法（犈犔犐犛犃）概述酶联免疫吸附法以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合的一种高敏感性的试验技术。由
12、于抗原、抗体的反应在一种固相载体聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。酶联免疫吸附法包括直接法、间接法、双抗体夹心法和三抗夹心法等。方案设计检测前，首先要根据检测需要设计酶联板点样孔。将使用的点样孔安排在内部，避免使用酶联板周围一圈的点样孔，防止边际效应的发生，影响检验结果的准确性。在一次血清学检测试验中，一般设置个阳性对照孔、个阴性对照孔、个空白对照孔作为质量控制，并根据送检样品数量设置待检测样品孔数量，要求每个待测样品设置两次重复。其次，需确定包被抗体和酶标抗体的最适浓度，或按照试剂盒推荐方法执行。样品选取及处
13、理要求选取幼嫩或处于萌芽状态的植物组织样品用于检测，如芽尖、幼叶等植物组织，避免选取成熟的植物组织样品。检测韧皮部中的病毒，应选取韧皮组织样品；检测树皮中的病毒，应选取带有形成层组织的样品；也可选取幼嫩的根部组织作为病毒检测样品。植物病毒粗提液的制备选取植物样品，一般按照适当的比例加入样品抽提缓冲液，制备一个植物病毒粗提液。如果提高植物样品所占比例，有可能减少酶联反应的几率，加大制备植物病毒粗提液的难度。相反，减少植物样品所占比例，则有利于酶联反应的进行。对于难于研磨的植物样品，可加入金刚砂或硅藻土等研磨剂，将有助于研磨。操作程序检测试验操作程序通常包括包被抗体、加样、孵育、包被酶标抗体、加底
14、物、显色和读板等步骤，具体方法参考试验标准步骤执行或按照试剂盒推荐方法执行。酶联免疫吸附（犈犔犐犛犃）结果判定在所有阳性对照、阴性对照和空白对照结果均成立的情况下，通过值进行判定。如果值在推荐的阳性判定标准范围内，则判定为阳性样品；如果值在推荐的可疑判定标准范围内，则判定犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售为可疑样品；如果值在推荐的阴性判定标准范围内，则判定为阴性样品。具体判定方法参见附录。免疫电镜概述免疫电镜是免疫学原理与电镜负染技术相结合的方法。利用包被在铜网上的抗体从含有病毒的植物组织粗提液中捕捉病毒粒子，在透射电子显微镜下清晰观察到病毒粒子形态结构。方案设计在试验中设置阴性对照和阳性对照
15、作为质量控制，并重复两次。选择表现症状的待检测样品制样，每个待测样品设置两次重复。样品的制备植物的叶、芽、种子、根等组织，还有病毒介体线虫、昆虫均可用于免疫电镜检测。植物病毒粗提液的制备按照的规定执行。抗体稀释倍数注意抗体稀释倍数，以减少寄主成分的非特异性结合。结果判定在阴性对照中不能观察到病毒粒子，而在阳性对照和待测样品中可以直接观察到病毒粒子，判定为阳性，需要拍照记录病毒粒子形态、大小及其周围由抗血清所形成的抗体晕圈。在阴性对照、待测样品中均不能直接观察到病毒粒子，在阳性对照能直接观察到病毒粒子，判定为阴性。在阴性对照中观察到病毒粒子或阳性对照中未观察到病毒粒子，无论是否在待测样品中观察到
16、病毒粒子，都需要重做试验。免疫快速诊断试纸条概述试纸条检测植物病毒是根据抗原抗体特异结合的原理，把特异抗体交联到试纸条上，当纸上被标记抗体和抗原特异结合后，层析到测试线区域被第二抗体捕获，形成红色沉淀线。多余的被标记抗体继续层析至质控线区域被捕获形成另一条红色沉淀线。结果测试线与质控线均显色判为阳性，只有质控线显色判为阴性。样品处理要求选取幼嫩或处于萌芽状态的植物组织样品，如芽尖、幼叶或病毒浓度较高的叶片等组织。病毒粗提液的制备方法同，但其需要进行适当稀释。操作步骤将试纸条垂直插入植物病毒粗提液中，注意避免将质控线浸入液体中，影响试验结果。按照生产商推荐步骤操作。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子
17、发售反应温度和时间按生产商推荐的反应温度和时间进行试验。免疫试纸条检测法的结果判定如果质控线不出现，判定检测结果无效。质控线与检测线同时出现判定为阳性。质控线为出现，检测线不出现，判定为阴性。分子生物学检测概述植物病毒的分子生物学检测方法以病毒特异性基因片段为检测对象，根据检测结果中特异性基因目标片段的有无，判别病毒存在与否。在植物病毒检测中常用的分子生物学检测方法包括聚合酶链式反应技术（）或反转录聚合酶链式反应技术（）、实时荧光定量技术、分子杂交、核酸序列测定和基因芯片等方法。实验室分区实验室应将不相容活动的相邻区域进行有效隔离，合理设计实验分区，防止不同区域间的交叉污染对实验结果造成影响。
18、具体参见。检测方法需要描述采用何种分子生物学检测方法。选择分子生物学检测所使用的方法应是国际标准、国家标准、行业标准或是公开发表的检测方法，同时，这些方法的可操作性（包括操作的难易、花费时间和速度）以及对操作人员所应具备的相关知识和经验都应具有普遍适用性；仪器的选用以及对照样品、试剂等的获取都应具有普遍适用性。常用的分子生物学检测方法为常规、实时荧光、基因芯片、测序检测等方法。方案设计在试验中设置阳性对照、阴性对照、空白对照作为质量控制，并设置多个待检测样品。样品选择和处理植物叶片、茎、鳞茎、树皮和果实等组织均可用于或检测。但最好选取幼嫩或处于萌芽状态的植物组织样品，如芽尖、幼叶等，避免选取成
19、熟的植物组织样品。检测样品的前处理要描述采用何种方法抽提或。如抽提，可选用法、法、试剂盒法等；而抽提可采用异硫氰酸胍法、苯酚法、法和试剂盒法等。一般根据样品性质，按照适当比例在样品中加入或抽提缓冲液，经研磨、离心等步骤，抽提得到植物总或。根据需要也可以加入三氯甲烷、酚等试剂除去植物蛋白对试验的影响。总核酸样品质量的检查通过电泳或测定核酸吸收值的方法，检查所抽提的总或的质量。结果判定常规犘犆犚结果判定在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，如样品的扩增产生特异性条带，该条带与犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售目标条带序列长度一致，则判定检测结果呈阳性；如该样品无特异性扩增条带，则判定检
20、测结果呈阴性。实时荧光犘犆犚检测结果判定在阴性对照、阳性对照、空白对照均正常的情况下：结果判定根据样品值进行判定，如值是否在标准曲线值范围内，判定为阳性或阴性。检测样品信噪比值介于阴性对照信噪比值和阳性质控信噪比值之间为可疑阳性，需要采用其他检测方法加以验证。基因芯片检测结果判定检测样品信噪比值大于或等于阳性质控信噪比值检测结果判定为阳性；检测样品信噪比值小于阴性对照信噪比值检测结果判定为阴性。检测样品信噪比值介于阴性对照信噪比值和阳性质控信噪比值之间为可疑阳性，需要采用其他检测方法加以验证。测序检测结果判定将测序得到的核苷酸序列与已知的该物种特异性标准序列进行比对，如果同源性符合种内判别标准
21、，则判定检测结果呈阳性，如果不符合种内同源性判别标准，则判定检测结果呈阴性。结果综合判定同时符合血清学检测和分子生物学检测结果为阳性，血清学检测和鉴别寄主鉴定结果为阳性，血清学检测方法中检测和免疫电镜两项检测结果为阳性的，可判定待检测样品带有目标病毒。检测过程中的防扩散措施和防污染措施防扩散措施在病毒检测全过程中均要防止病毒的扩散。在取样时应用密闭袋，防止所取样样品在传递过程中散失遗漏；检测后的余样，如发现有检疫性病毒的应要烧毁，或高压消毒，以防止病毒随余样进行扩散；对检测后的洗涤液、玻璃器皿等要进行高压灭菌处理。防污染措施对病毒检测全过程均要建立防污染措施。要定期对实验室中的微生物进行监控，
22、定期用紫外光进行处理，防止空气中的病毒核酸气溶胶对检测结果的污染。隔离检疫温室防污染措施定期对隔离检疫温室喷洒杀虫剂或开启紫外线灯照射消毒。进入隔离检疫温室前应洗手，在缓冲室内更换工作服、帽、鞋，并且只能在隔离检疫温室内使用。试验用品消毒对检测过程所需的器皿及器械需经高温湿热灭菌或高温干热灭菌或高温湿热灭菌，在使用过程中避免交叉污染。所需的水以及试剂能灭菌处理的需经灭菌处理。开封启用过的无菌物品应灭菌后使用；无菌物品应分类放置，并定期检查。记录隔离检疫记录检测人员在检疫过程中详细填写检疫记录，每项检测完成出具隔离检疫实验室检验结果报告。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售基本信息报检单号、委托单
23、位、样品名称、接样日期、产地、样品编号、随单附证等。检验检疫依据国家标准、行业标准或实验室的非标等，注明标准编号。检测方法鉴别寄主鉴定、免疫电镜、血清学检测或分子生物学检测方法及其他方法。检测结果描述必要时要附病毒电镜照片、电泳结果、实时荧光结果图或血清学检测结果等。检测信息检疫员拟稿人、复核审核人、检测日期等。样品与毒源的保存样品的保存保存样品要标明样品编号、样品名称、保存人、保存日期和到期日期；植物病毒检测结果为阳性的样品应保存年，以备复验；样品保存过程要保证生物安全，防止植物病毒发生逃逸；要由专人记录保存室的温度和湿度；样品保存期满后，需经除害处理。毒源保存保存方法选择适合的毒源保存方法
24、，保证其活性，注意不发生变异、不被污染。保存要求毒源保存要对同一种病毒同时保存不少于份，以避免应毒源的失活而导致该病毒毒源的丧失；保存的毒源要写明保存时间，并确保书写日期不应保存而导致信息丧失；毒源保存要确保保存设备处于正常工作状态，每天由专人记录保存设备的温度。针对检疫性病毒毒源的保存要设立双人双锁制度，以防止检疫性病毒在出入库时的安全。保存的毒源应定期接种寄主复壮，一般为个月，以确保毒源不失活及鉴定特性不改变。检测结果的复核病毒检测实验室要建立检测结果复核制度；对首次检出的病毒要由国家质量监督检验检疫总局指定单位的专家进行复核，主要考察实验记录、照片等资料的完整性和真实性，必要时进行复核实
25、验；病毒复核要出具复核报告。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售附录犃（资料性附录）平行允许率判定法犃当阳性样品孔有颜色反应，阴性对照孔无颜色反应，且阴性对照孔值小于，如果小于按计算，且重复检测样品值平行允许率（犃）小于时则判定检测结果有效。计算待测样品值和阴性对照值之比值（）。若大于，血清学检测结果判定为阳性。若值接近，需重复检测可疑样品（如果选用商品检测试剂盒，则按照试剂盒的判定标准执行）。犃样品值的平行允许率按式（）进行计算：犃（）（）式中：犃平行允许率；重复样品；重复样品。犛犖犜版权所有 禁止翻制、电子发售书书书犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准植物病毒检测规范中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街号邮政编码：网址电话：中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本印张字数千字年月第一版年月第一次印刷印数书号：定价元版权所有 禁止翻制、电子发售
