1、ICS 67.120.30 B 51 DB13 河北省 地方标准 DB13/T 2746 2018 西伯利亚鲟种质鉴定规范 2018 - 07 - 16 发布 2018 - 08 - 16 实施 河北省质量技术监督局 发布 DB13/T 2746 2018 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由河北省农业厅提出。 本标准起草单位：河北省海洋与水产科学研究院、河北农业大学海洋学院、保定市水产技术推广 站、曲阳县满鑫鲟鱼繁育养殖有限公司。 本标准主要起草人：肖 国华、宫春光、高晓田、 任雪莲、 张建修、徐荣郅、王东辉、胡志山、殷 蕊、张耀红。 DB13/T 2
2、746 2018 1 西伯利亚鲟种质鉴定规范 1 范围 本标准规定了西伯利亚鲟（ Acipenser baerii）的学名与分类、生物学特征、生长与繁殖、遗传 学特性、检测方法与检验规则。 本标准适用于西伯利亚鲟的种质检测与鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 18654.1 养殖鱼类种质检验 第 1部分 ： 检验规则 GB/T 18654.2 养殖鱼类种质检验 第 2部分 ： 抽样方法 GB/T 18654.3 养殖鱼类种质检验 第
3、3部分 ： 性状测定 GB/T 18654.4 养殖鱼类种质检验 第 4部分 ： 年龄与生长的测定 GB/T 18654.6 养殖鱼类种质检验 第 6部分 ： 繁殖性能的测定 GB/T 18654.13 养殖鱼类种质检验 第 13部分 ： 同工酶电泳分析 GB/T 18654.14 养殖鱼类种质检验 第 14部分 ： DNA含量的测定 GB/T 18654.15 养殖鱼类种质检 验 第 15部分 ： RAPD分析 3 学名与分类 3.1 学名 西伯利亚鲟（ Acipenser baerii） 。 3.2 分类地位 属鲟形目（ Acipenseriformes） , 鲟科（ Acipenseri
4、dae） ,鲟属 (Acipenser)。 4 生物学特征 4.1 外部形态 鱼体修长，呈纺锤形，横切呈五角形，向尾部延伸变细，吻长尖，口腹位，口裂较小，一字形。 歪形尾，鳃盖骨愈合为一 ,鳃盖膜彼此不相连而与颊部相连。体裸露无鳞具 5列骨板， 1列背骨板， 2列 侧骨板， 2列腹骨板；第一背骨板不是最大的骨板 ,身体最高点不在第一骨板处；侧骨 板通常与躯干部 颜色相似；腹骨板与背骨板间具有许多星状薄骨板或微小颗粒，吻须 4根，介于吻突与口裂之间，稍靠 近口裂。鳃耙有结节，一般为 3个。鱼体背部呈淡灰黑色或暗褐色，两侧较淡，腹部为白色。 西伯利亚鲟的外部形态见图 1。 DB13/T 2746
5、2018 2 图 1 西伯利亚鲟外形 4.2 可数性状 背鳍鳍式： D.30 56。 臀鳍鳍式： A.17 33。 背骨板数： 10 20。 侧骨板数： 37 56，通常为 42 47。 腹骨板数： 7 16。 第一鳃弓（左）外侧鳃耙数： 20 49，通常为 27 32。 4.3 可量性状比例 西伯利亚鲟可量性状比例见 表 1。 表 1 西伯利亚鲟的可量性状比例（平均值标准差） 项 目 指 标 8 月龄鱼 3 龄鱼 10 龄鱼 全长 /体长 a 1.310.04 1.250.06 1.280.04 体长 /体高 6.650.64 6.150.04 5.530.51 体长 /头长 3.690.2
6、5 3.790.34 4.090.28 头长 /吻长 1.740.17 2.090.18 2.090.17 头长 /眼径 22.131.97 23.526.72 23.704.21 头长 /眼间距 3.590.48 3.170.39 3.290.30 头长 /尾柄高 8.471.23 6.391.51 5.751.01 尾柄长 /尾柄高 2.840.64 2.280.57 2.50.52 a 采用从吻端到尾鳍基部的长度 5 生长与繁殖 5.1 生长 在人工养殖条件下 ， 不同年龄组的西伯利亚鲟鱼体长和体重范围见表 2。 DB13/T 2746 2018 3 表 2 西伯利亚鲟各年龄组体长和体重
7、范围 项目 指标 1 龄鱼 2 龄鱼 3 龄鱼 4 龄鱼 5 龄鱼 体长（ cm） 40 50 50 70 70 85 90 100 100 120 体 重（ g） 400 600 1500 2000 3000 4000 5000 7000 7000 9000 a 依据北方地区流水养殖模式，年龄以周年计 5.2 繁殖 性成熟年龄：自然条件下雌鱼为 19龄 20龄，雄鱼为 17龄 18龄；人工养殖条件下雌鱼为 7龄以上， 雄鱼为 5龄以上。繁殖周期：野生状态下为 2年以上；人工养殖条件下为 1年以上。怀卵量占体重的 10% 30%。 6 遗传学特征 6.1 西伯利亚鲟 DNA 含量 西伯利亚鲟细
8、胞中 DNA含量为 N=8.980.115 pg。 6.2 生化遗传学特征 西伯利亚鲟肝脏酯酶（ EST） 同工酶有 6条酶带，电泳图及酶带电泳模式图见图 2。 1-电泳图谱， 2-模式图 图 2 西伯利亚鲟肝脏酯酶电泳图谱及模式图 6.3 分子遗传学标记 6.3.1 西伯利亚鲟特异性 RAPD 遗传图谱的建立及特征标记 RAPD引物（ CCGCCCAAAC） PCR扩增的结果如图 3所示。 DB13/T 2746 2018 4 1-西伯利亚鲟池， 2、 3-西伯利亚鲟个体， 4-marker 图 3 RAPD 引物的扩增产物 6.3.2 西伯利亚鲟微卫星 DNA 分子标记的建立 采用 14对
9、微卫星引物进行基因型鉴定，西伯利亚鲟在这 14对引物的等位基因长度范围见表 3。基因 型数据分析结 果见图 4。 表 3 14 个微卫星引物序列及其在西伯利亚鲟的等位基因长度范围 位点名称 引物序列 (5 -3) 等位基因长度范围 (bp) Atr-1101 F： TATCCCCTCCACTGGAAAT R： GTTAAACATCCCTGCCTTCA 143 203 Atr-105 F:CGATTTGATTGGCTCTTGTA R:TGCAAATAAATTGGAGCTGA 157 173 Atr-107 F:GGCAGGATTACATCTCCTGA R:TTACTAACTGCTAGATAATA
10、CCTCTCT 188 242 Atr-109 F:ACCCGAGCTGTCACATTACT R: AAAATAACGCGAATTCCTGA 162 300 Atr-114 F:GCAATTCGTGTTATGTTCATTT R: TGCATTCAGAGAATAACCGA 201 251 Atr-117 F:TGCATGACACAGGACTTACC R: TGCCTCTCAATAGCAACATC 191 259 Abr39 F:ACCCGCAATTATTAGGAC R: CAGGACAAACTCAGACCC 178 276 Abr40 F:TCACGCAGTCTCACAAGG R: TTCAAT
11、GGCAAACAGCAC 384 418 Abr41 F:ACACTATCCCGCCACAAT R: CCACTGAAGCCATCATCT 322 410 Afu19 F:CATCTTAGCCGTCTGTGGTAC R: CAGGTCCCTAATACAATGGC 120 139 Afu22 F:TCCACAATCCTGAATAATGAC R: GCACCATCTAATACGAAATTG 140 242 Afu39 F:TTCTGAAGTTCACACATTG R: ATGGAGCATATTGGAAGG 119 140 Afu54 F:CTCTAGTCTTTGTTGATTACAG R: CAAAG
12、GACTTGAAACTAGG 149 221 Afu68 F:TTATTGCATGGTGTAGCTAAAC R: AGCCCAACACAGACAATATC 128 250 DB13/T 2746 2018 5 1、 西伯利亚鲟品种池， 2、 非西比利亚鲟样品 。 图 4 微卫星标记基因型数据分析结果图 7 检测方法 7.1 抽样方法 按 GB/T 18654.2执行。 7.2 性状检测 按 GB/T 18654.3执行。 7.3 年龄与生长测定 按 GB/T 18654.4执行。 7.4 繁殖性能 测定 按 GB/T 18654.6执行。 7.5 DNA 含量测定 按 GB/T 18654.1
13、4执行。 7.6 同工酶 测定 样品制备、电泳分析按 GB/T 18654.13执行 。 7.7 分子遗传学标记方法 7.7.1 DNA 的提取 DNA的提取按 GB/T 18654.15执行。 7.7.2 PCR 扩增反应 扩增反应总体积为 25 L，其中包括摸板 DNA30 ng、 10PCR缓冲液（含 Mg2+） 2.5 L、 d NTPS（ 2.5m Meach） 2 L、 Taq酶（ 5 u/L） 0.3 L、引物 1 p M（ RAPD法和微卫星 DNA法分别使用各自的引物）。 RAPD法反应程序为： 95 预变性 5 min， 94 45 s、 36 45 s、 72 90 s，
14、 45cycles， 72 延 伸 5 min。 DB13/T 2746 2018 6 微卫星 DNA法反应程序为： 94 变性 45 s、退火 45 s（各引物退火温度详见表 4）、 72 延伸 45 s， 40cycles， 72 再延伸 5 min。 扩增反应结束后，取 5 L产物与 1 L上样缓冲液混合点样，在含溴化乙锭的 1.4%琼脂糖凝胶中电 泳 1 h 2 h，电压 80 v，紫外灯下观察结果并拍照记录。 表 4 14个微卫星位点重复序列结构和退火温度 位点名称 重复序列结构 退火温度（ ） Atr-1101 (TATC)10 55 Atr-105 (GATA)15 50 Atr
15、-107 (TAGA)17 57 Atr-109 (GA)5(TAGA)20 55 Atr-114 (TAGA)23 60 Atr-117 (GATA)8 55 Abr 39 (TATC)18 58 Abr 40 (TCTA)6(TAGA)12 61 Abr 41 (TCTA)17 65 Afu19 (TTG)5 53 Afu22 (TAAA)5(GAA)19 52 Afu39 (CAA)14 55 Afu54 (GATA) 2(GATA) 2 55 Afu68 (GATA)21 55 7.7.3 结果分析 7.7.3.1 RAPD 法结果分析 向 PCR产物中加入上样缓冲液， 94 解链 5
16、 min，迅速置于冰中冷却至室温， 4 保存备用。 使用 95%酒精把长板擦洗一遍，待酒精挥发后涂 1.5 mL亲和溶液；再使用 95%酒精把短板也擦洗一 遍，待酒精挥发后涂 200 L剥离溶液。取 6%变性聚丙烯酰胺溶液 80 mL，加入 60 L四甲基乙二胺， 180 L的 10%过硫酸铵（现用现配），充分混匀后灌入两块玻璃之间。用鲨鱼齿梳子的背面沿两玻璃板缝 隙水平插入胶中约 5 mm 6 mm。等约 1.5 h待凝胶聚合后，拔出梳子，用水 将玻璃板表面冲洗干净，擦 干后装在电泳槽上。向电泳槽的上下缓冲液槽中加入 0.5TBE缓冲液，使缓冲液没过短板。 1800 V恒 压预电泳 20 m
17、in。预电泳之后，在每个加样孔中加入 5 L解链后样品， 1800 V恒压电泳 1.5 h 2.5 h。 电泳结束后，小心分离两块玻璃板，将粘有凝胶的长板浸入染色液中，染色 5 min 15 min，用蒸 馏水漂洗 30 s，浸入在显影液中显影至带型清晰，再用蒸馏水漂洗 5 min。晾干长板后，拍照记录结果。 7.7.3.2 微卫星 DNA 法结果分析 使用普通微卫星引物进行 PCR扩增时，基 因型判读同上述 RAPD法。 使用荧光微卫星引物进行 PCR扩增时，直接使用基因分析仪进行基因型判读。 使用软件 STRUCTURE 2.3对基因型数据进行综合分析。 8 检验 与判定 规则 检验规则按 GB/T 18654.1执行 ， 各项检测指标 均符合第 4、 5、 6条规定 则判定为西伯利亚鲟。 _
