1、ICS 65.150 B 52 备案号 :46592-2015 DB11 北京市地方 标准 DB11/T 1220 2015 西伯利亚鲟全人工繁殖技术规范 Specifications of artificial propagation techniques on Siberian sturgeon （ Acipenser baerii） 2015-07 - 08发布 2015 -11 - 01实施 北京市质量技术监督局 发布DB11/T 1220 2015 I 目 次 前言 . II 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 术语和定义 1 4 亲鱼培育 1 5 亲鱼挑选 1 6 人工催产
2、2 7 精液采集与保存 2 8 鱼卵采集 3 9 人工授精 3 10 脱粘 . 3 11 孵化 . 3 12 出苗 . 4 附 录 A （资料性附录） 5 参考文献 6 DB11/T 1220 2015 II 前 言 本标准按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。 本标准由北京市农业局提出并归口。 本标准由北京市农业局组织实施。 本标准起草单位：北京市水产科学研究所。 本标准主要起草人：胡红霞、朱华、董颖、姚 志刚 、李立成 、郭洪胜 。 DB11/T 1220 2015 1 西伯利亚鲟全人工繁殖技术规范 1 范围 本标准规定 了西伯利亚鲟 （Acipenser baerii） 全 人
3、工 繁殖时 的亲鱼培育 及挑选、人工催产、精液 采集与保存、鱼卵采集、人工授精、脱粘、孵化和出苗的 技术要 求。 本标准 适用 于西伯利亚鲟 的全人工 繁殖 。 2 规范性引用文件 下列文件 对于 本文件的 应用 是必不可少 的。 凡是注日期的引用文件 ，仅 所 注日期的 版本 适用 于 本文 件。凡是不注日期 的引用文件，其最新版 本（ 包括 所有的 修改 单） 适用 于本文件。 DB11/T 1932003 鲟鱼 养殖技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义 适用 于本文件。 3.1 全人工繁殖 artificial propagation 在 人工 养殖条 件下从 苗种 培育到 性腺发
4、育成熟 的亲鱼 使 用外源 性激素 催产 等技 术 进行 人工 繁殖 。 3.2 极化指数 polarization index 鱼卵动物极到 卵核 的距离 与动物极到植物极 的距离之比。 4 亲鱼培育 4.1 人工培育 人工繁 育的苗 种或 性腺发 育在II 期之前的 野生 鱼 种,在 水 泥池 、 池塘或 工厂化 车间等 人工养殖条 件 下， 按照 DB11/T 193 2003的要 求， 培育 成为 性腺发 育达到 IV期，能够 人工催产的亲鱼。性 腺分期方法 见 附录 A。 4.2 亲鱼性成熟年龄 雌鱼性 成熟年龄 68 龄，雄 鱼 4 5龄。 5 亲鱼挑选 5.1 雌鱼选择 DB11
5、/T 1220 2015 2 用 挖 卵 器 从雌 鱼体内取 出卵 子， 目测 卵呈灰黑色 ， 用 卡尺量长 卵径大 于2.6mm 。 将卵子放入 水中煮2 min3 min ， 晾凉后 用刀片沿 卵的 长轴切开 ， 计算 极化 指数 。挑选鱼卵 极化 指数小于 1/20的雌 鱼用 于 催 产。极 化指数计算 方法见 公式（ 1）。 式中： PI 极化 指数； l 1 鱼卵 动物极到 卵核 的最短 距离 ； l 2 鱼卵 动物极到植物极 的 距离 。 5.2 雄鱼选择 穿刺取 性腺， 目测 性腺 呈白色或 乳白色 ，显微镜压片检测 可见到 精子 。 6 人工催产 6.1 药物种类 人工催产 药
6、物可 选用 促黄体 素 释放 激素 类似 物 （ LHRH-A）单 独 使 用 ,或 者 和 地欧酮 （ DOM） 混合 使用。 6.2 注射剂量 雌 鱼： 每千克 鱼体重 LHRH-A用 量为 30 g100 g；每千克鱼 体重混合 DOM用量 为 1mg2mg。 雄鱼： 每千克 鱼体重 LHRH-A用 量为 20 g50 g。 6.3 注射次数 雌 鱼 一般 为两次 注射 ， 第一次注 射10% 的剂量 ， 10h15h 后注 射90% 的剂量； 雄鱼一次 注射 ，在雌鱼 第二次 注射 前2h 6h 注射 。 6.4 注射方法 可 采 取背鳍基部 下方 肌肉 注射和 胸鳍基部 注射两 种方
7、法，注 射操作完 成后拔针头 时应 用手指轻轻按 摩 注 射处 ,使 药物 尽量 不外流 。 7 精液采集与保存 7.1 采集时间 注 射 催产 药 物10h左右开始检 查 雄鱼 ， 轻压 雄鱼 腹 部时发现 乳白色 精液 流出， 即可开始 采集精液 ， 初次采集 后每 隔5h左右检 查并采集 1次 ，一般 可以 采集 3 4次 。 7.2 采集方法 导管吸 出法 ： 将医 用导管与 医 用注 射器 前端相连， 用 干燥毛巾 将生殖 孔周 围体 表擦干；轻压 腹部 有 少 量 精液 排出 时， 将导管深 入 雄鱼 生殖 孔内 ， 用 注射器抽 取精液。 宜使 用内径 3mm、 长 度5cm 的
8、 医 用 导管 和 100ml的医 用注 射器 。使用工具均需消毒 。 DB11/T 1220 2015 3 7.3 精液保存 将取出的精液 移入 干燥烧杯 中 ， 封 口后放入 冰箱 0 4保存。采出 后和 使用前的精液 均应 用显微 镜进行 精子 活力 检测 。 8 鱼卵采集 8.1 挤压法 用 干燥毛巾擦干 生殖孔周围 ， 挤 压腹 部两 侧，将 鱼卵 挤 入 干燥容器内 。 挤压法 采卵需 间隔1h 2h 多次采集 ，直 到挤 压腹 部无 鱼卵 排出 为止 。 8.2 手术法 使用100 mg/L 的 间氨 基 苯甲酸乙酯甲磺酸盐 （MS-222 ） 或 50 mg/L的丁香酚溶 液麻
9、醉 雌鱼， 然后 固 定在操作 台上 ，用75%酒 精 消毒腹 部，用 手术 刀在距生殖孔 前方10cm左右 的腹部切一 个3cm 5cm 切口 ， 从鱼体 腹部两 侧由 头部 向尾 部 反复挤 压， 将鱼卵 从切口 处 挤出 ； 或 用不 锈钢匙 从 切口伸 入腹腔 取出鱼卵 ， 放 在 干燥容 器内 。鱼卵 全部取出 后， 用聚丙烯丝线缝 合切 口， 并对 缝合部 位用 碘酒消毒 。 所有使 用工 具均 应消毒 。 9 人工授精 9.1 精液用量 根据精液 浓度 及精 子活力确 定 使用精液 体积 ，每公 斤鱼卵 使用 10ml20ml精液。 9.2 人工授精方法 根据鱼卵 总 量， 计算
10、 需 要的精液 量。用 养殖池 水 快速稀释 精液50 100 倍后 倒 在鱼卵 上，用 羽毛 搅 动3min 5min进行 人工授精。授精 时宜 选择 活力 强的精液 混合 使用。 10 脱粘 使用医 用滑石粉配 成20% 30%的水 溶液 ， 将 受精卵 倒 入含有 该溶 液的 容器内 ， 用 手 工或 脱粘 装置搅 动40min 60min。 每公 斤受 精卵 使用 10L15L 滑石粉 溶 液。 为防 止缺氧 ， 宜 搅动20min 30min 后 ， 更换 一次滑石粉 溶液。 11 孵化 11.1 孵化装置 可 选用 尤先 科筛网 式孵化 器或麦 克唐纳瓶 式孵化 器。 11.2 孵
11、化条 件 11.2.1 温度 保持水 温13 16 。 DB11/T 1220 2015 4 11.2.2 溶氧 不小于 6mg/L。 11.2.3 光照 避免阳光 直射 。 11.2.4 孵化用 水 经过不 大于 150目的 筛绢过滤 ， 避免 将敌害 生物 带入 。 11.3 孵化期日常管理 11.3.1 水霉控制 应及时 拣出 死卵。 在 孵化 初期， 每日 用5mg/L的 亚 甲基 兰浸泡 鱼卵 15min； 在 接近 鱼卵 破膜 时停 止浸泡。 11.3.2 受 精 率统计 在鱼卵 发育 到原肠 中后 期时 开始 统计 受精 率。 12 出苗 水温13 16 ，受 精卵孵化6d 1d
12、 开始 出苗 ；温 度越低 ，出苗 时间 越长 。 尤先科 筛网 式孵化 器鱼苗孵出后 留在方 槽内，及时捞 出孵出 仔鱼， 放入 鱼苗培育池 ； 麦克 唐纳瓶 式 孵化器 在开始 出苗 时架设 水槽，使 孵出鱼苗 直接 流入 集鱼 箱或 鱼苗培育 池。 DB11/T 1220 2015 5 附 录 A （ 资料 性附录 ） 西伯利亚鲟雌性性 腺发育 分期方法 A.1 性腺I 期 性腺外 观呈 透明带状 ， 肉 眼看不见 卵粒， 辨认 不出卵 巢 与精 巢。 切片 可见到正 在分 裂的卵 原细胞簇 及 直 径 40 m 100 m的卵 母细胞 ，卵母细胞 具有 较大 的细胞 核， 占整 个细胞
13、 大小 的一 半 以上 ，细胞核 内只见核 质还没 有核 仁出 现。 A.2 性腺II 期 期卵 巢呈 淡黄色 被脂肪覆盖，在 切片中 观察 初级 卵母细胞 在数量 上和 面积上 占 优势 。 此 期卵母细 胞 体 积 较 卵 原细胞 大， 直径 约 100 m 500 m，细胞质 增多 ， 细胞 核明 显，核 膜内 壁有 1圈 核仁分 布。 期后 期卵 母细胞 的核 仁数显著增加 ，大小 不等， 排列在核 膜内 缘。 A.3 性腺III 期 卵 巢 中卵 粒呈灰色 ， 切片 可观察 到卵 细胞近 似椭圆形 ，外包 滤泡细胞 ，核 仁 变 小数目 增多 ， 并且密 集 排 列在核 膜内 侧 。
14、 细胞质 内 含有 较多 的卵 黄颗 粒，分 布 于 细胞质 的大部 分 区域 。 在 滤泡细胞膜 和核膜 之间出 现一 环状 的脂肪 滴， 此 期细胞 核在 中央 没有发生极 化。 A.4 性腺IV 期 IV期卵 巢中 卵呈 深褐 色 ， 椭圆形 ， 脂肪 极少， 体 积增 大，细胞 长轴 直径 1500 m2500 m，核 径与 胞 径 比值减小 。根据 细胞 核偏移 情况将 该期 卵母细胞 分为 早、中 、晚3 个发 育 阶段。 当卵细胞 发育 到中 期 阶段时， 细胞核向动物极移动， 开始极化。到 IV期 末 , 核极 化 到 PI值小于 0.1左右 , 可以进行人工催 产 繁殖 。
15、A.5 性腺V 期 发育到V 期的卵 巢 ，卵 呈黑褐 色 ，充满腹腔 ，卵 开始 从滤泡膜 内释 出，在动物极 用 肉眼 可 观察 到灰 白色的 圆斑 ， 即 极斑，在动植物极 相交 处色 素沉 积， 形 成明 显的 深色 圆环 ， 即 极 环。卵 核 膜 消 失 ，极 化 核 切 面形 状不 规则 ，接近 动物极 。卵 黄至 卵膜 外侧 有黑色 颗粒 层、 绒毛 膜层 和残存的 部分 滤泡膜 。 A.6 性腺VI 期 VI期卵 巢的卵 已经 产出 ，未 产出的卵 会退 化凋亡 被鱼 体 吸收 ，卵 巢中 剩下少 量期 卵母细胞 。 DB11/T 1220 2015 6 参 考 文 献 1
16、Williot P, Brun R. Ovarian development and cycles in cultured Siberian sturgeon A. baeriJ. Aquatic living Resources, 1998, 11(2): 111-118. 2 Webb M A H, Van Eenennaam J P, Doroshov S I, et al. Preliminary observations on the effects of holding temperature on reproductive performance of female white
17、sturgeon, Acipenser transmontanus RichardsonJ. Aquaculture, 1999, 176(3): 315-329. 3 Williot P, Brun R, Rouault T, et al. Artificial spawning in cultured sterlet sturgeon, Acipenser ruthenus L., with special emphasis on hermaphroditesJ. Aquaculture, 2005, 246(1): 263-273. 4 Dettlaff T A, Ginsburg A
18、S, Schmalhausen O I. Sturgeon fishes: developmental biology and aquacultureM. New York: Springer-Verlag, 1993. 5 胡红霞, 刘晓春 , 朱华 , 林浩 然.养殖 俄罗斯 鲟性 腺发育 及人工 繁殖 J.中 山 大 学学 报 (自 然 科学 版) 2007， V0l46（ 1）： 81-85. 6 张 照斌 ， 牛翠娟， 朱华， 胡红霞 . 室 内饲 育西伯利亚鲟 的血清 性类 固醇 激素 的 周年 变化 J.北京 师 范 大 学学 报（ 自然 科学 版） ， 2003，39 （4）：
19、 519-524. 7 Williot P, Kopeika E F, Goncharov B F. Influence of testis state, temperature and delay in semen collection on spermatozoa motility in the cultured Siberian sturgeon (Acipenser baeri Brandt)J. Aquaculture, 2000, 189(1): 53-61. 8 胡红霞, 刘晓春 , 朱华 , 林浩 然 .鲟 鱼 GtH放射 免疫测 定方法 的建 立及催产前后 史氏鲟 血清GtH
20、含 量 的变化 J.水产学 报,2008， V0l32（ 6）： 817-824. 9 Doroshov S I, Moberg G P, Van Eenennaam J P. Observations on the reproductive cycle of cultures white sturgeon, Acipenser transmontanusJ. Environmental Biology of Fishes, 1997, 48(1-4): 265-278. 10 Amiri B M, Maebayashi M, Hara A, et al. Ovarian developmen
21、t and serum sex steroid and vitellogenin profiles in the female cultured sturgeon hybrid, the besterJ. Journal of Fish Biology, 1996, 48(6): 1164-1178. 11 Amiri B M, Maebayashi M, Adachi S, et al. Testicular development and serum sex steroid profiles during the annual sexual cycle of the male sturgeon hybrid the besterJ. Journal of Fish Biology, 1996, 48(6): 1039-1050. 12 孟庆闻 ,苏锦详 ,缪 学 祖. 鱼 类分 类学 M.北京： 中 国农业出 版社 ,1995. 13 鲟鱼 种质 鉴定规范. 北京市 地方 标准 S.DB11/T 9872013. 14 田美平 ，庄平 ， 张涛， 颜世伟 ， 章龙珍 ，刘婷 . 西伯利亚鲟 性腺早 期发生、 分 化、 发 育的组织学 观察J. 中国 水产科学 ， 2010， 17(3): 496-506. _
