1、ICS 11.220 B 41 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 31212018 群血清 4 型禽腺病毒核酸 PCR 检测 技术规程 Technical Regulations of PCR Assay for Detection of Fowl Aviadenovirus Serotype 4 Nucleic Acid 文稿版次选择 2018 - 04 - 16 发布 2018 - 05 - 16 实施 安徽省质量技术监督局 发布 DB34/T 31212018 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由阜阳市畜牧兽医局提出。 本标准由安徽省农业
2、标准化技术委员会归口。 本标准起草单位： 阜阳市立华畜禽有限公司、 阜阳市动物疫病预防与控制中心、 阜阳市畜牧兽医局、 颍东区畜牧兽医局、阜阳市动物卫生监督所。 本标准主要起草人：孟宪臣、张海涛、郭强、李东风、桑晓媛、高树朋、高永士、潘五岳、郑玉才、 罗燕、刘新、薛亚梅、吴含萍、张娟娟。 DB34/T 31212018 1 群血清 4 型禽腺病毒核酸 PCR 检测技术规程 1 范围 本标准规定了群血清 4 型禽腺病毒核酸 PCR 检测技术。 本标准适用于对活禽肛拭子和病死禽肝脏进行群血清 4 型禽腺病毒的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅
3、所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 21674 猪圆环病毒聚合酶链反应试验方法 3 缩略语 以下缩略语适用于本文件。 FadV（Fowl Aviadenovirus）：群禽腺病毒。 FAdV-4（Fowl Adeno virus-4）：群血清 4 型禽腺病毒。 PCR（Polymerase Ch ain Reaction）：聚合酶链式反应。 DNA（Deoxyribonu cleic Acid）：脱氧核糖核酸。 ExTaq 酶： 从水生栖热菌 Thermus Aquaticus
4、 （Taq） 中分离出的具有热稳定性的 DNA 聚合酶， ExTaq 酶是其中的一种。 PBS（Phosphate Buf fer Solution）：磷酸盐缓冲液。 SPF（Specific Pa thogen Free）：无特定病原。 4 主要仪器 4.1 高速台式冷冻离心机 4.2 生物安全 II 级通风柜 4.3 PCR 扩增仪 4.4 核酸电泳仪 4.5 微量移液器（2 L、10 L、100 L、1000 L） 4.6 超低温冰箱 4.7 核酸凝胶成像系统 4.8 高压蒸汽灭菌锅 4.9 电热恒温鼓风干燥箱 4.10 微量振荡器 DB34/T 31212018 2 5 主要试剂 5.
5、1 消化液(见第 A.1 章) 5.2 2蛋白酶 K 溶液（见第 A.2 章） 5.3 酚-三氯甲烷-异戊醇混合液（见第 A.3 章） 5.4 75乙醇（见第 A.4 章） 5.5 Gold View 核酸染料 5.6 上游引物 P1：FAdV-4（10 M） 5.7 下游引物 P2：FAdV-4（10 M） 5.8 琼脂糖（分析纯） 5.9 50TAE 缓冲液（见第 A.5 章） 5.10 PBS（见第 A.6 章） 5.11 DL2000 DNA Marker（见第 A.7 章） 5.12 10Loading Buffer（见第 A.7 章） 5.13 双蒸水（符合 GB/T 6682 要
6、求） 5.14 PCR 用 ExTaq（见第 A.8 章） 5.15 10ExTaq buffer(Mg2+ plus)（见第 A.8 章） 5.16 dNTP Mixture（见第 A.8 章） 6 引物 根据 GenBank 登录的 FAdV-4 (GenBank:GU188428.1)Hexon 基因核苷酸序列，设计用于扩增 FAdV-4 的 PCR 引物， FAdV-4 上游引物 P1： FAdV-4（5- GACCGTTACAAGTTTAGCATCTCC-3） ， FAdV-4 下游引物 P2：FAdV-4（5- TCGCAGGAAGTCGTAGTGGA-3），扩增核酸片段大小为 9
7、51 bp。 如果制备的核酸模板中有 FAdV-4，PC R 产物电泳后在 951 bp 处出现条带，即为阳性，反之即为 阴性。 7 样品的采集和处理 7.1 采样工具 7.1.1 棉拭子和 1.5 mL 离心管，经 121高压灭菌 15 min，烘干。 7.1.2 剪刀、镊子和研磨器，经 160干热灭菌 2 h。 7.2 样品采集 7.2.1 活禽 取泄殖腔拭子，采集方法如下： 取泄殖腔拭子时，将拭子深入泄殖腔转一圈并沾取少量粪便； 将拭子一并放入盛有 1.0 mL 含双抗 PBS（高压冷却后的 PBS，无菌条件下加入青霉素、链霉 素各 10000 IU/mL）的 1.5 mL 离心管中，加
8、盖标记。 7.2.2 病死禽 病死禽剖检并取肝脏装入一次性塑封袋或其他灭菌容器，标记，送实验室。 DB34/T 31212018 3 7.3 样品储运 样品采集后，放入密闭的塑封袋内（一个采样点的样品，放在一个塑封袋内），于保温箱中加冰、 密封，24 小时内进行样品处理。 7.4 样品处理 7.4.1 泄殖腔拭子 样品在震荡器上充分混合后，取上清液转入无菌的 1.5 mL 离心管，编号备用。 7.4.2 组织脏器 取待检样品约 2.0 g 于洁净、干热灭菌的研磨器中充分研磨，加 5 mL PBS 混匀，反复冻融 3 次 后，取上清液转入无菌的 1.5 mL 离心管，编号备用。 7.5 处理后的
9、样品存放 制备的样品在 2-8条件下保存应不超过 24 h，如需长期保存应置 -70以下，并应避免反复 冻融。 8 检测步骤 8.1 实验室规范 群血清 4 型禽腺病毒核酸 PCR 检测的实验室规范应符合 GB 19489 的要求。 8.2 核酸提取 8.2.1 核酸提取参考 GB/T 21674 的要求。 8.2.2 取n个灭菌的1.5 mL 离心管，其中 n 为被检样品、阳性对照和阴性对照数量之和，编号。其中 阳性对照样品为血清学鉴定为 FAdV-4 的病料或阳性病料接种 SPF 鸡胚收获的尿囊液，阴性对照样品为 灭菌双蒸水。 8.2.3 每管加入待检样品（已研磨好的被检样品上清，阳性对照
10、样品和阴性对照样品）100 L，加入 500 L消化液和10 L 2蛋白酶 K 溶液，混匀，置 55水浴中 4 h16 h。 8.2.4 每管加入 600 L 酚-三氯甲烷-异戊醇混合液，用力颠倒 10 次混匀，13000 g 离心 10 min。 8.2.5 取上清 500 L 置 1.5 mL 灭菌离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，置 -70冰箱中 30 min， 取出离心管，室温融化，4，20000 g 离心 15 min。 8.2.6 弃上清，沿离心管开口方向管壁缓缓滴入 1 mL -20预冷的 75乙醇溶液，轻轻旋转洗一次后 倒掉，将离心管倒扣于吸水纸上 1 min，置 37干燥箱干
11、燥 30 min。 8.2.7 取出离心管，用 50 L 灭菌双蒸水溶解沉淀，作为模板备用。若需长期保存须放置在 -70冰 箱。 8.3 检测 8.3.1 扩增试剂准备 从 ExTaq 试剂盒中取出相应的 10 ExTaq buffer(Mg 2+ plus)、 ExTaq 酶和 dNTP Mixture，同时 取出 FAdV-4 PCR 扩增引物和双蒸水。 DB34/T 31212018 4 设所需 PCR 的检测总数为 n，其中 n 为被检样品、阳性对照与阴性对照之和，每个样本测试反应 体系配制见表1。 表1 每个样本测试反应体系配置表 试剂 用量 /L 10 ExTaq buffer(M
12、g 2+ plus) 2 dNTP Mixture 1 P1：FAdV-4（10 M） 0.5 P2：FAdV-4（10 M） 0.5 ExTaq 酶 0.3 DNA 模板（质量浓度大于 129.6 pg/L） 2 灭菌双蒸水 补至 20 8.3.2 加样 在各设定的 PCR 管中分别加入 8.2.6 中制备的 DNA 溶液各 2 L，瞬时离心数秒。 8.3.3 PCR 反应 将 8.3.2 中离心后的 PCR 管放入 PCR 扩增反应仪内，并对 PCR 管编号，记录对应样本。 反应条件设置： 第一阶段，94预变性 5 min； 第二阶段，94变性 30 s，53退火 30 s，72延伸 50
13、 s，30 个循环； 第三阶段，72延伸 10 min。 8.3.4 PCR 产物电泳检测 琼脂糖凝胶的配制： 按 1比例称取琼脂糖加入适量 1TAE 电泳缓冲液中，用微波炉加热完全溶解后，按 1:10000 的比例加入 Gold View 核酸染料，摇匀后倒入试剂中，待冷却使用。 每个样本的 PCR 管取 9 L 的 PCR 产物，加入 1 L 的 10 Loading buffer，混匀后，吸取 10 L 样品加入配制好的琼脂糖凝胶中，同时加入 DL2000 DNA Ma rker，之后在电压 100 V 下，经 15 30 min 电泳，将凝胶放入凝胶成像系统中进行观察，并拍照记录。 9
14、 结果判定 9.1 实验成立条件 9.1.1 阴性对照样品在 951 bp 位置处无条带。 9.1.2 阳性对照样品在 951 bp 位置处有清晰条带。 9.2 结果描述及判定 9.2.1 阴性 样本对应的泳道在 951 bp 位置处无条带，表示样品中无群血清 4 型禽腺病毒核酸。 DB34/T 31212018 5 9.2.2 阳性 样本对应的泳道在 951 bp 位置处出现明显的条 带，表示样品中存在群血清 4 型禽腺病毒核酸 (见附录第A.9 章) DB34/T 31212018 6 A A 附 录 A （规范性附录） 实验用溶液配制 本标准所用试剂均为分析纯 A.1 消化液 A.1.1
15、 1 mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCL） （pH 8.0） 三羟甲基氨基甲烷 12.11 g 灭菌双蒸水 80 mL 浓盐酸 调 pH 至 8.0 灭菌双蒸水 加至 100 mL A.1.2 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH 8.0） 二水乙二铵四乙酸二钠 18.61 g 灭菌双蒸水 80 mL 氢氧化钠 调 pH 至 8.0 灭菌双蒸水 加至 100 mL A.1.3 20十二烷基硫酸钠（SDS）溶液（pH 7.2） 十二烷基硫酸钠 20 g 灭菌双蒸水 80 mL 浓盐酸 调 pH 至 7.2 灭菌双蒸水 加至 100 mL A.1.4 消化液
16、1 mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-H CL）（pH 8.0） 2 mL 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH 8.0） 0.4 mL 20十二烷基硫酸钠（SDS）溶液（pH7.2） 5 mL 5 mol/L 氯化钠 4 mL 灭菌双蒸水 加至 200 mL A.2 2蛋白酶K溶液 蛋白酶 K（分析纯） 5 g 灭菌双蒸水 加至 250 mL A.3 酚-三氯甲烷-异戊醇混合液 DB34/T 31212018 7 碱性酚 25 mL 三氯甲烷 24 mL 异戊醇 1 mL A.4 75乙醇 无水乙醇（100）（分析纯） 750 mL 灭菌双蒸水 250 mL
17、 A.5 50TAE（三羟甲基氨基甲烷-乙酸）电泳缓冲液 羟基甲基氨基甲烷（Tris）（分析纯） 242 g 冰乙酸 57.1 mL 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液（pH 8.0） 100 mL 灭菌双蒸水 加至 1000 mL 用时用灭菌双蒸水稀释使用。 A.6 PBS(磷酸盐缓冲液) A.6.1 A 液 0.2 mol/L 磷酸二氢钠水溶液：磷酸二氢钠（NaH 2PO4* H 2O）27.6 g，溶于蒸馏水中，最后稀释至1000 mL。 A.6.2 B 液 0.2 mol/L 磷酸氢二钠水溶液：磷酸氢二钠（Na 2HPO4* 7H2O）53.6 g，加蒸馏水溶解，最后稀释至 10
18、00 mL。 A.6.3 0.01 mol/L、pH 7.2 磷酸盐缓冲液的配制 0.2 mol/L A 液 14 m L，0.2 mol/L B 液 36 mL，加氯化钠（NaCl）8.5 g，用蒸馏水稀释至 1000 mL，121高压灭菌 15 min。 A.7 DL2000 DNA Marker试剂盒 DL2000 DNA Marker 500 L 10Loading Buffer 1 mL A.8 ExTaq 试剂盒 ExTaq（5 U/ L） 50 L 10ExTaq buffer(20 mM Mg 2+ plus) 1 mL dNTP Mixture（各 2.5 mM） 800 L DB34/T 31212018 8 A.9 FAdV-4 PCR电泳图 见图A.1。 图中： M：DL2000 Marker； 1：阳性对照样品； 2：阴性对照样品； 3-5：检测样品。 图A.1 FAdV-4 PCR 电泳图 _
