1、ICS 11.220 B 41 DB37 山东省 地方标准 DB37/T 4038 2020 鸡 CpG 寡脱氧核苷酸疫苗佐剂制备 技术规程 Preparation technique of CpG oligonucleotide adjuvant for chicken vaccines 2020 - 07 - 09 发布 2020 - 08 - 09 实施 山东省市场监督管理局 发布 DB37/T 4038 2020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东
2、省农业科学院畜牧兽医研究所、齐鲁师范学院、山东润达检测技术有限公司。 本标准主要起草人：张琳、吴家强、朱广伟、黄艳艳、于江、张玉玉、许传田 、艾武、张秀美、刘 军伟。 DB37/T 4038 2020 1 鸡 CpG 寡脱氧核苷酸疫苗佐剂制备技术规程 1 范围 本标准规定了鸡特异性 CpG寡脱氧核苷酸疫苗佐剂的制备、检测、贮存等方面的技术规程。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 2008 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语与
3、定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 CpG寡脱氧核苷酸 CpG oligonucleotide， CpG ODN 含有未甲基化的 CpG二核苷酸基序的核酸序列，能够在机体内诱导强烈的免疫反应。 3.2 硫代修饰 phosphorthioate modified 将核酸序列磷酸二酯键中的非桥氧原子置换成硫原子，主要用于防止反义实验中核酸被核酸酶降 解。 3.3 熔解温度 melting temperature， Tm 在 DNA双螺旋结构热变性过程中紫外吸收值达到最大值的 1/2时的温度。 3.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳 polyacrylamide gel electrophoresis，
4、 PAGE 用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对 DNA片段进行分离，然 后从凝胶中回收、纯化目的 DNA。 3.5 OD值 optical density value 表示被检测物吸收掉的光密度，是检测方法里的专有名词，检测单位用 OD值表示。 4 试剂或材料 DB37/T 4038 2020 2 除另有规定外，所用试剂均为分析纯。 4.1 水：符合 GB/T 6682 2008 一级水规定。 4.2 三羟甲基氨基甲烷 -乙二胺四乙酸 (TE)缓冲液：附录 A.1。 4.3 生理盐水。 4.4 去内毒素质粒大提试剂盒。 5 仪器设备 5.1 微量移液器： 2.5 uL、 10 uL、 200 uL、
5、1 000 uL。 5.2 高速离心机：离心力 13 000 转 /分钟。 5.3 无菌注射器： 1 mL、 5 mL。 5.4 冰箱：低于 -20 。 5.5 紫外分光光度计：波长范围 200 nm 380 nm。 5.6 超净工作台或生物安全柜。 5.7 天平：精度 0.1 mg。 5.8 滤器： 0.45 um。 5.9 恒温摇床：振荡频率 10 400 转 /分钟，温度范围为室温 70 。 6 佐剂的制备 6.1 单链形态佐剂的制备 鸡种属特异性 CpG ODN序列： 5 -TCGTCGAACGTTCGAGATGAT-3，全链或两端硫代修饰，分子量 6782.43 g/mol， Tm值
6、 58.01。序列由生物公司合成，采用 PAGE及以上纯化方式纯化，建议合成量 20 OD/管，分装 2管。 6.2 双链形态佐剂的制备 6.2.1 重组质粒的构建 6.2.1.1 目的片段为含 8 拷贝鸡种 属特异性 CpG ODN 序列（同 6.1）的基因片段。目的片段 5端添 加 Sal I 酶切位点（ gtcgac）， 3端添加 Xho I 酶切位点 (ctcgag)，单拷贝序列间以碱基 CTAGA 连接。 目的片段和原核表达质粒 pET21a 分别经 Sal I 和 Xho I 内切酶双酶切后，使用 T4 DNA 连接酶进行重组 连接。 6.2.1.2 将重组质粒转化至大肠杆菌感受态
7、细胞 DH5中，在 LB 固体培养基（附录 A.2）平板上 37 倒置培养约 8 12 小时后，挑取单克隆菌落至 LB 液体培养基（附录 A.3）中， 37 条件下进行摇动过 夜培养。 6.2.2 重组质粒的提取 6.2.2.1 用去内毒素质粒大提试剂盒进行重组质粒的提取。提取操作参照试剂盒说明书进行。 6.2.2.2 用 0.45 um 的滤器过滤提取质粒，去除细菌、蛋白等杂质。纯净的双链重组质粒形态稳定， 无需硫代修饰。 7 检测 DB37/T 4038 2020 3 7.1 单链形态合成产品 取一支 CpG ODN佐剂合成品 (含 10 OD CpG ODN)放入高速离心机， 12 00
8、0转 /分钟离心 3 5分钟，加 水 5 mL，溶解混匀后取 100 uL，加入光径为 1 cm的石英比色杯，然后加入 900 uL水，混匀后用紫外分光 光度计测定 260 nm处的数值，如为 0.2证明 CpG ODN含量正常，如低于 0.2说明 CpG ODN含量过低，合成量 不足。 7.2 双链形态重组质粒 取 CpG ODN重组质粒 20 uL，加入 980 uL水对质粒样品进行 50倍稀释后加入光径为 1 cm的石英比色杯， 用紫外分光光度计分别测定 260 nm和 280 nm处的数值，当 OD260/OD280在 1.8 1.9之间时，且根据质粒 浓度计算公式得出的重组质粒浓度高
9、于 1 500 ug/mL时方可应用。其中，质粒浓度计算公式为 50 OD260 值稀释倍数（单位为 ug/mL） 8 贮存 8.1 单链形态合成 产品 8.1.1 CpG ODN 合成产品为干膜状物质，长期贮存应在 -20 以下。 8.1.2 已用水或 TE 缓冲液溶解配制的 CpG ODN 佐剂应尽快使用完毕，短期 -20 以下冷冻保存，避免 反复冻融。 8.2 双链形态重组质粒 CpG ODN重组质粒溶解于水后 应于 -20 以下冷冻保存，避免反复冻融，有效期不超过 12个月。 9 操作注意事项 9.1 CpG ODN 佐剂的制备产品和贮存应保证无菌。 9.2 CpG ODN 重组质粒的
10、转化和培养应保证无外源菌感染。 9.3 CpG ODN 合成产品呈无色干膜状，质轻，打开时极易散失，故开盖前需离心。 9.4 CpG ODN 佐剂现用现 配（制备），尽快用完，以减少核酸的降解。 10 说明 10.1 本标准规定的 CpG ODN 佐剂可用于疫苗生产企业生产疫苗和养殖企业稀释疫苗。 10.2 本标准规定的 CpG ODN 佐剂可用于鸡用冻干疫苗和液体疫苗。 DB37/T 4038 2020 4 A A 附 录 A （资料性附录） 试剂的配制 A.1 TE缓冲液 1 TE缓冲液 1 L中含 1 M 三羟甲基氨基甲烷 -盐酸（ pH 8.0） 10 mL 0.5 M 乙二胺四乙酸（
11、 pH 8.0） 2 mL 加水定容至 1 L，高压灭菌，室温保存。 A.2 LB固体培养基 1L LB固体培养基中含 胰蛋白胨 10 g 酵母提取物 5 g 氯化钠 10 g 琼脂粉 15 g 加水 950 mL，溶解后用 1M的 NaOH调节 pH值到 7.0，定容至 1 L，高压灭菌，待冷却至 50 60 时， 加入 1 mL氨苄青霉素（ 100 mg/mL）后混合均匀，倒制平板。 A.3 LB液体培养基 1L LB液体培养基中含 胰蛋白胨 10 g 酵母提取物 5 g 氯化钠 10 g 加水 800 mL，溶解后用 1 M的 NaOH调节 pH值到 7.0，定容至 1 L，高压灭菌，冷却至室温，加入 1 mL 氨苄青霉素（ 100 mg/mL）后混合均匀。 _
