1、ICS 65.020.01 B 40 DB37 山东省地方标准 DB 37/T 20312012 奶牛 DNA亲子鉴定技术规程 Technical Specification for DNA Parentage Identification in Dairy Cattle 2012 - 02 - 09发布 2012 - 03 - 01实施 山东省质量技术监督局 发布 DB37/ T 20312012 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心、山东省畜
2、牧总站、山东奥克斯生物技术有限公 司。 本标准主要起草人：黄金明、张思聪、鞠志花、李建斌、李荣岭、李秋玲、侯明海、曲绪仙、仲跻 峰。 DB37/ T 20312012 1 奶牛DNA 亲子鉴定技术规程 1 范围 本标准规定了奶牛DNA亲子鉴定的技术方法。 本标准适用于奶牛DNA亲子鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 NY/T 1672-2008 绵羊多胎主效基因FecB分子检测技术规程 SN/
3、T 1193 基因检验实验室技术要求 SN/T 1917-2007 牛地方流行性白血病聚合酶链反应操作规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 亲子鉴定 （parentage id entification） 利用分子遗传学、生物学及医学的理论和技术判断亲代与子代是否具有血缘关系。 3.2 亲权指数( paternity index,PI ) 假设亲代提供生父（母）基因成为孩子生父（母）的可能性和随机亲代亲提供生父（母）基因成为 孩子生父（母）的可能性的比值。 3.3 LOD 值 亲权指数的对数值。 3.4 亲权（父、母）相对机会（Relative c hance pater
4、nity，RCP） 表示疑似亲代是真实亲代的机会。 RCP的计算： DB37/ T 20312012 2 1+ = PI PI RCP .(1) 式中： PI亲权指数。 多个标记累计的PCP计算： RCPI）（RCP = 111累计 .(2) 式中： RCPi第 i标记的RCP。 3.5 微卫星 （DNA micro satellite） 也称短串联重复序列 (STR) 或简单重复序列(SSR)。是一类广泛存在于真核生物基因组中的，核心 序列为26bp, 重复次数通常为1530次的DNA串联重复序列。 3.6 多重聚合酶链反应（multiplex PCR） 又称多重引物PCR或复合PCR，是指
5、在同一 PCR反应体系中加入两对以上引物，同时扩增出多个核酸 片段的PCR反应。 4 鉴定原理 利用常染色体微卫星分型技术，选取不同染色体上的微卫 星位点，采用多重PCR技术扩增微卫星标 记，检测微卫星位点的遗传多态性，分型得出各位点等位基因的大小，通过软件统计分析，确定或排除 亲子关系。 5 主要试剂配制 除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6682的双蒸水；高压灭菌条件为1.034105Pa 压力，蒸汽灭菌20min。试剂配制见附录A。 6 主要仪器设备 见附录B。 7 检测方法 7.1 样本采集 静脉采集血样35 mL，ACD抗凝，4或-20保存。对公牛，亦可采集23剂细管
6、精液，液氮保存。 7.2 DNA 提取 DB37/ T 20312012 3 7.2.1 血液DNA 的提取 用酚-氯仿抽提法从抗凝血和血凝块中提取基因组DNA。抗凝血和血凝块的处理按照SN/T 1917-2007 的规定执行。DNA的提取按照 NY/T 1672-2008中的规定执行。也可用商业化DNA提取试剂盒提取DNA。 7.2.2 精液DNA 提取 从细管中取出精液放入1.5mL离心管中，然后，加入500 L生理盐水，混匀，12000 rpm离心1min， 弃除上清液，保留底部的白色沉淀。重复上述步骤一次。加入精子DNA抽提液400 L及5 L蛋白酶K，旋 涡混合器悬浮；56消化101
7、2h，至溶液澄清透明；加入300 L苯酚，轻轻混匀，12000rpm离心10min； 小心吸取上清液，转至1.5mL离心管中，加入150 L酚和150 L氯仿，轻轻混合5min；吸取上清液，加入 500L 无水乙醇（4保存），轻轻颠倒混合；用灭菌枪头将白色沉淀挑出，1mL的70%乙醇洗涤，凉干， 加入400 L 双蒸水，充分溶解，4或-20保存。 7.3 DNA 浓度和纯度检测 按照 NY/T 1672-2008的规定执行。 7.4 引物序列 引物序列参考联合国粮农组织(FAO)和国际动物遗传学会(ISAG)的推荐引物。 12个微卫星标记分为4 个扩增组合，具体见附录C。 7.5 PCR 扩增
8、 7.5.1 多重 PCR 扩增体系 产物扩增分4次PCR反应完成。同一扩增组合的引物加入同一PCR反应管中。25L反应体系：10 Buffer2.5L、50mmol/L MgCl 2 1.2L、10mmol/L dNTP 0.6L、Taq DNA聚合酶2U、10mol/L引物(扩增 组合)各1.0L、待测个体模板DNA （或者阳性对照 DNA）100ng、加双蒸水至反应总体积为25L。PCR扩 增时设计阴性对照（双蒸水作为模板）。 7.5.2 PCR 扩增条件 94预变性5min；94变性30s，5760.5 退火30s，72延伸30 s，35个循环；72延伸5min， 4保存。 7.6 P
9、CR 产物琼脂糖凝胶电泳检测 7.6.1 先用水清洗制胶板，再用 1TAE 冲洗一次，水平放置。 7.6.2 根据电泳胶板的规格和检测样品的数量，配制 1%的琼脂糖溶液，在微波炉中加热融化至溶液澄 清透明，室温下冷却至 60左右时，加入溴化乙锭并混匀，使 EB 的终浓度为 0.5g/mL。 7.6.3 将混合液缓慢倒入制胶板中，排除气泡，插入多齿梳子。待凝胶凝固后，拔出梳子，将凝胶转 移至水平电泳槽中，往电泳槽中加入 1TAE 缓冲液，使电泳缓冲液没过胶面。 7.6.4 将待检 PCR产物 5 L 和上样缓冲液（6DNA Loading Buffer）以 5:1 的比例混合均匀，加入 点样孔；
10、同时选择点样孔点上 5 L 2000bp DNA Marker 作参照。恒压 100V，电泳 30min。电泳结束后 于凝胶成像系统观察,并分析记录。 7.7 微卫星 DNA多态性分析 DB37/ T 20312012 4 PCR产物、去离子甲酰胺和TAMRA内标按 0.5 L:lOL:O.5L比例混合，95变性5min，ABI PRISM 3100仪器测序，ABI PRISM 3100 DATA COLLECTION软件分析微卫星的基因型。FAM、HEX和TAMR A分别表 示蓝色、绿色和黑色。 8 结果判定 8.1 多重 PCR 产物检测 若4个PCR管均出现清晰条带，表明产物扩增成功，可
11、以进行测序。 图1 多重 PCR 产物 2%琼脂糖凝胶电泳图 注： 1- TGLA53、INRA023位点两重PCR产物；2- TGLA227、TGLA122、BM1818位点三重PCR产物；3 - BM2113、ETH225、 ILSTS006位点三重PCR产物；CSRM60、BM1824、ETH10、SPS115位点四重PCR产物；M:DL 500 DNA Marker。 8.2 微卫星标记分型 利用ABI3100仪器对微卫星标记进行基因分型。 检测个体的12个微卫星标记的基因分型结果如附录D 所示，根据相对荧光强度和片段大小，可获得 待测个体不同STR标记的基因型。不同亲缘关系的个体，
12、其微卫星标记的等位基因大小不同，表现出不同的基因型。阳性对照样品12个STR标记不同等位基因的 大小如附录E所示。 8.3 亲子关系判定 根据待检个体STR标记的基因型，利用Cervux3 .0软件分别计算其亲子指数的LOD值。当LOD0时， 候选亲本有可能是真实的亲代，LOD值最高的个体是最相似的亲本个体，其RCP值即表示该亲本是真实亲 本的机会；当LOD0时，候选亲本不可能是真实的亲本。 9 废弃物的处理 按照NY/T 1672 的规定执行。 10 检测过程中防止交叉污染的措施 按照SN/T 1193 的规定执行。 DB37/ T 20312012 5 A A 附 录 A （资料性附录）
13、主要试剂配制 A.1 ACD抗凝剂 柠檬酸0.48 g、柠檬酸钠1.32 g、葡萄糖1 .47 g，定容于100 mL水中，高压灭菌。 A.2 10% SDS(十二烷基硫酸钠) 100 g SDS溶于90 mL水中，加热至68助溶，用HCl调pH至7.2，定容至1000mL，0.2m的滤膜过滤， 高压灭菌。 A.3 PBS（磷酸缓冲液） 8g NaCl、0.2g KCl、1.44 g Na2HPO4、0.24g KH2P O4 溶于800mL蒸馏水中，用HCl调pH 值到7.4，加 水定容至1L，高压灭菌，室温保存。 A.4 0.5 mol/L NaCl（氯化钠） 5.844g NaCl溶于双
14、蒸水中，加水定容至200mL，高压灭菌。 A.5 蛋白酶K(20mg/mL) 200 mg蛋白酶K定溶于10mL水中，以1mL分装，-20冷冻保存。 A.6 氯仿 异戊醇（24:1）：异戊醇21mL加入到500mL的氯仿试剂瓶中，混匀。 A.7 1 mol/L Tris.HCl(pH=8.0) 将121.1 g Tris溶于80 0 mL水中，加浓盐酸调pH至8.0，定容至1000 mL，高压灭菌。 A.8 0.5 mol/L EDTA(pH8.0) 800 mL水中加入186.1g E DTA-Na22H2O（二水合乙二胺四乙酸二钠），在磁力搅拌器上剧烈搅拌， 用NaOH调节溶液pH至8.0
15、，然后定容至1L，高压灭菌。 A.9 TE缓冲液 DB37/ T 20312012 6 取1 mol/L Tris.HCl（pH8.0）10mL，0.5 mol/L EDTA（pH 8 .0）2mL，加水定容至1L，高 压灭菌， 室温保存。 A.10 血样裂解液 1mol/L Tris.HCl(pH=8.0)1mL，0.5mol/L EDTA(pH=8.0)20mL，10% SDS 5m L，双蒸水74mL。 A.11 精子DNA抽提液 称取二硫苏糖醇0.06g与 1mL 0. 5mol/L Tris.Cl，0.5mol/L EDTA，5mol/L NaCl，2m l 10%SDS混合 后，补
16、水至10mL。 A.12 10mg/mL溴化乙锭 在10mL水中加入100mg的溴化乙锭（EB），溶解后分装成1mL小份，4保存。 A.13 50TAE缓冲液 Tris-base242g，冰乙酸57.1mL，0.5mo l/L EDTA (pH8.0)100mL，加水定容至1000mL。 A.14 %的琼脂糖 2g琼脂糖充分溶解于1TAE，定容至100mL。 A.15 琼脂糖电泳上样缓冲液 0.25%溴酚兰；0.25%二甲苯菁FF；40%的蔗糖水溶液。 DB37/ T 20312012 7 B B 附 录 B （资料性附录） 主要仪器设备 B.1 单道可调移液器 2L，10L，20L，100L
17、，200L，1000L。 B.2 基因扩增仪 温度范围4-99,温度梯度范围20,模块单元960.2mL。 B.3 离心机 最高转速12000r/min，最大容量241.5mL。 B.4 恒温振荡器 0r/min -200r/min，0-60。 B.5 电子天平 量程0.001g-100g，感量0.001g。 B.6 旋涡混合器 转速2800r/min，工作台直径110mm。 B.7 手持式均质器 转速范围5000-35000rpm ，处理量0.05-100mL。 B.8 紫外分光光度计 波长范围 200-1000 nm。 B.9 凝胶成像分析系统 有效像素12801024，检测灵敏度 DNA
18、0.05ng。 B.10 稳压稳流电泳仪 DB37/ T 20312012 8 输出电压 0-600V，输出电流0-100mA。 B.11 水平电泳槽 外形尺寸182mm85mm5mm，凝胶板面积60mm60mm。 B.12 高压灭菌锅 使用温度范围45-135，最高使用压力0.255Mpa。 B.13 自动双重纯水蒸馏器 功率3000W，出水量2500mLh。 B.14 微波炉 容积20L，尺寸262mm 452mm365mm。 B.15 干燥箱 温控范围50-300，箱内尺寸350mm 350mm450mm。 B.16 冰箱 4,-20。 DB37/ T 20312012 9 C C 附
19、录 C （规范性附录） 微卫星基因座及其引物序列 表C.1 微卫星基因座及其引物序列 扩 增 组 合 基因座 染 色 体 引物序列 (5 - 3) 退火温度 （） 片段范围 (bp) 荧光标 记 CSRM60 10 AAGATGTGATCCAAGAGAGAGGCA AGGACCAGATCGTGAAAGGCATAG 60.5 96-116 HEX BM1824 1 GAGCAAGGTGTTTTTCCAATC CATTCTCCAACTGCTTCCTTG 60.5 170-218 TAMRA ETH10 5 GTTCAGGACTGGCCCTGCTAACA CCTCCAGCCCACTTTCTCTTCT
20、C 60.5 198-234 FAM 1 SPS115 15 AAAGTGACACAACAGCTTCTCCAG AACGAGTGTCCTAGTTTGGCTGTG 60.5 240-270 FAM BM2113 2 GCTGCCTTCTACCAAATACCC CTTCCTGAGAGAAGCAACACC 58 116-146 FAM ETH225 9 GATCACCTTGCCACTATTTCCT ACATGACAGCCAGCTGCTACT 58 132-166 TAMRA 2 ILSTS006 7 TGTCTGTATTTCTGCTGTGG ACACGGAAGCGATCTAAACG 58 281-2
21、99 FAM TGLA227 18 CGAATTCCAAATCTGTTAATTTGCT ACAGACAGAAACTCAATGAAAGCA 57 63-115 FAM TGLA122 21 CCCTCCTCCAGGTAAATCAGC AATCACATGGCAAATAAGTACATAC 57 133-193 HEX 3 BM1818 23 AGCTGGGAATATAACCAAAGG AGTGCTTTCAAGGTCCATGC 57 248-276 HEX TGLA53 16 GCTTTCAGAAATAGTTTGCATTCA ATCTTCACATGATATTACAGCAGA 57 147-197 FA
22、M 4 INRA023 3 GAGTAGAGCTACAAGATAAACTTC TAACTACAGGGTGTTAGATGAACTC 57 194-236 HEX DB37/ T 20312012 10 D D 附 录 D （规范性附录） 微卫星座位的测序荧光检测信号图 图D.1 12 个微卫星座位 ABI 3100 测序荧光检测信号图 CSRM60(98， 100) BM1824(182，184) ETH10（215,221） SPS115（245,245） DB37/ T 20312012 11 TGLA227（92,105） ETH225（140,148） BM2113(124,134) I
23、LSTS006（288,288） TGLA227（92,104） DB37/ T 20312012 12 附 录 E （资料性附录） 12个微卫星分别为CSRM60、BM1824、ETH10、SPS115、BM2113、ILSTS006、ETH225、TGLA 227、TGLA122、 BM1818、TGLA53、INRA023； X轴表示片段长度，Y轴表示相对荧光强度。 TGLA53（156,160） INRA023（211, 213） TGLA122（149,175） BM1818（261,265） DB37/ T 20312012 13 E E 附 录 E （规范性附录） 对照 DNA 的12 个微卫星标记的等位基因大小 表E.1 对照 DNA 的12 个微卫星标记的等位基因大小 微卫星基因座 等位基因1 等位基因2 CSRM60 98 100 BM1824 178 180 ETH10 215 219 SPS115 248 248 BM2113 125 137 ETH225 140 144 ILSTS006 288 292 TGLA227 87 97 TGLA122 143 155 BM1818 266 270 TGLA53 160 168 INRA23 206 214 _
