DB12 T 1189-2023 牛亲子鉴定技术流程.pdf
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1、ICS65.020.30CCS B 4312天津市地方标准DB12/T 11892023牛亲子鉴定技术规程Technical specification for parentage identification in cattle2023-04-07 发布2023-05-07 实施天津市市场监督管理委员会发 布DB12/T 11892023I前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由天津市农业农村委员会提出并归口。本文件起草单位:天津市农业科学院。本文件主要起草人:马毅、赵欣、陈丽丽、张漫、谭冬飞、赵康、芦娜、王丽学。DB12/
2、T 118920231牛亲子鉴定技术规程1范围本文件规定了牛亲子鉴定的技术方法。本文件适用于牛(Bos taurus)亲子鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和实验方法GB/T 27642牛个体及亲子鉴定微卫星DNA法NY/T 1672绵羊多胎主效基因FecB分子检测技术规程SN/T 1193基因检验实验室技术要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1等位基因数allele,A反映群
3、体遗传变异大小的一个指标,其数值越接近所检测到的等位基因的绝对数,表明等位基因在群体中分布越均匀。3.2期望杂合度heterogosity,He期望杂合度主要是根据种群内当前优势等位基因的分布频率来推算的,稀有基因的贡献极其微弱。3.3多态信息含量polymorphic information content,PICDNA的多态性指标。111221212ninijjiniiPPPPICPi和Pj分别为第i个和第j个等位基因频率,n为等位基因数。3.4排除概率PE在亲子鉴定中一个随机的个体被排除为亲生父亲的概率,是评价微卫星标记在亲子鉴定中实用价值大小的一个指标。DB12/T 118920232
4、(1)当没有另一亲本信息时,排除子代与假设亲本是亲子关系的排除概率:ninininiPPPPp432234)(2412(2)累计排除概率:)1()1)(1(121kPPPCPE3.5微卫星 DNAmicrosatellite又称短串联重复序列(STR)或简单重复序列(SSR),一类广泛存在于真核生物基因组中的,核心序列为26 bp,重复次数通常为1530次的DNA串联重复序列。3.6多重聚合酶链反应multiplex PCR又称多重引物PCR或复合PCR,在同一PCR反应体系中加入两对以上引物,同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。4鉴定原理利用常染色体微卫星分型技术,选取不同染色体上的微卫星位
5、点,采用多重PCR技术扩增微卫星标记,检测微卫星位点的遗传多态性,分型得出各位点等位基因的大小,通过软件统计分析,确定或排除亲子关系。5试剂配制水为符合 GB/T 6682 的一级水;高压灭菌条件为 1.034105 Pa 压力,蒸汽灭菌 20 min。试剂配制如下:ACD 抗凝剂:柠檬酸 0.48 g、柠檬酸钠 1.32 g、葡萄糖 1.47 g,定容于 100 mL 水中,高压灭菌;10%SDS(十二烷基硫酸钠):100 g SDS 溶于 90 mL 水中,加热至 68助溶,用 HCl 调 pH至 7.2,定容至 1000 mL,0.2 m 的滤膜过滤,高压灭菌;PBS(磷酸缓冲液):8
6、g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4、0.24 g KH2PO4溶于 800 mL 蒸馏水中,用 HCl 调 pH 至 7.4,加水定容至 1000 mL,高压灭菌,室温保存;0.5 mol/L NaCl(氯化钠):5.844 g NaCl 溶于双蒸水中,加水定容至 200 mL,高压灭菌;蛋白酶 K(20 mg/mL):200 mg 蛋白酶 K 定溶于 10 mL 水中,以 1 mL 分装,-20冷冻保存;氯仿:异戊醇(24:1):异戊醇 2 mL 加入到 500 mL 的氯仿试剂瓶中,混匀;1 mol/L Tris-HCl(pH=8):将 121.1 g Tris
7、 溶于 800 mL 水中,加浓盐酸调 pH 至 8.0,容至 1000 mL,高压灭菌;0.5 mol/L EDTA(pH=8):800 mL 水中加入 186.1 g EDTA-Na22H2O(二水合乙二胺四乙酸二钠),在磁力搅拌器上剧烈搅拌,用 NaOH 调节溶液 pH 至 8.0,然后容至 1000 mL,高压灭菌;TE 缓冲液:取 1 mol/L Tris-HCl(pH=8)10 mL,0.5 mol/L EDTA(pH=8)2 mL,加水定容至 1000 mL,高压灭菌,室温保存;DB12/T 118920233血样裂解液:1 mol/L Tris-HCl(pH=8)1 mL,0.
8、5 mol/L EDTA(pH=8)20 mL,10%SDS 5 mL,双蒸水 74 mL;精子 DNA 抽提液:称取二硫苏糖醇 0.06 g 与 1 mL 0.5 mol/L Tris-HCl,0.5 mol/L EDTA,0.5 mol/L NaCl,2 mL 10%SDS 混合后,补水至 10 mL;50TAE 缓冲液:Tris-base 242 g,冰乙酸 57.1 mL,0.5 mol/L EDTA(pH=8)100 mL,加水定容至 1000 mL。使用时稀释 50 倍或 100 倍 即 1TAE;2%琼脂糖:2g 琼脂糖充分溶解于 50TAE,定容至 100 mL;琼脂糖电泳上样
9、缓冲液:0.25%溴酚蓝;0.25%二甲苯菁 FF;40%蔗糖水溶液;10Buffer:0.05%色素溴酚蓝;MgCl2(50 mmol/L):分子量为 95.211,计算配制所需固体溶质的质量,用托盘天平称取固体 MgCl2加入一级水溶解;dNTP(10mmol/L):dNTP 溶于 pH 为 7.0 的 NaOH 贮存液中,最初的贮存液可稀释到 10mol/L,分装后存放在-20冰箱中;Taq DNA 聚合酶:Taq DNA 聚合酶长为 832 个氨基酸,分子量为 94 Kd。该酶可以广泛用于 PCR、RT-PCR 和加尾反应等;GoldView:可代替溴化乙锭(EB)的新型核酸染料;6D
10、NA Loading Buffer:0.05%色素溴酚蓝;0.05%二甲苯菁 FF;2000 bp DNA Marker:2000 DNA Marker 是由 2000 bp、1000 bp、750 bp、500 bp、250 bp以及 100 bp 共 6 条线状双链 DNA 片段组成,保存于 1DNA Loading Buffer 中,可直接用于电泳分析;去离子甲酰胺:产品规格:100 mL,分子式:CH3NO,分子量:45.04;四甲基罗丹明(TAMRA):溶剂:DMSO,储存条件 20C 干燥避光保存有效期为 12 个月。6仪器设备6.1单道可调移液器0.252.5 L、110 L、2
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