1、ICS 65.020.40 B 61 DB51 小熊猫亲子鉴定技术规范 四 川 省 地 方 标 准 DB51/T 2649 2019 2019- 12 - 17发布 2020- 01 - 01实施 四川省市场监督管理局 发布 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语与定义 . 1 4 样品采集与保存 . 1 5 DNA 的提取与保存 . 2 6 微卫星标记选用 . 3 7 实验流程 . 3 8 亲子鉴定数据的管理 . 4 附录 A（规范性附录 ） 小熊猫样品采集记录表 . 5 附录 B（ 规范性附录 ） 小熊猫微卫星标记信息表 . 6 DB51/T 2
2、649 2019 II 前 言 本标准根据 :GB/T1.1-2009标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写起草。 本标准附录 A、附录 B 为 规范性附录 。 本标准 由四川省林业 和草原局 提出 并归口。 本标准 由 四川省 市场监督管理 局批准。 本标准起草单位： 成都大熊猫繁育研究基地。 本标准主要起草人： 张亮、侯蓉、张志和、沈富军、张文平、兰景超、杨旭煜、古晓东、黄祥明、 吴孔菊、李明喜、陈玲、吴里霞、杨智、罗娌、杨奎兴、卓贵富、谢军金、刘红、刘佳文、王涓、黄文 俊。 DB51/T 2649 2019 1 小熊猫亲子鉴定技术规范 1 范围 本标准规定了 小熊猫亲子鉴定 有关
3、术语定义、 DNA提取保存、亲子鉴定、个体识别的技术。 本标准适用 于四川省 圈养小熊猫亲子鉴定、个体识别、遗传多样性评估和遗传档案建立 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件 的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 CJJ/T 263-2017 动物园动物管理技术规程 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 微卫星标记 Microsatellite marker 基因组中的简单 串联 重复 DNA片段 。 3.2 DNA样品 DNA samples 是指利用小熊猫 组织、
4、 血液或粪便提取的小熊猫基因组 DNA。 3.3 微卫星个体识别 Microsatellite Individual identification 采用微卫星技术进行个体识别，以确认个体身份。 3.4 微卫星亲子鉴定 Microsatellite Paternity testing 是 采用微卫星技术， 根据遗传性状在子代和亲代之间的遗传规律，判断 亲代 和子 代 之间是否亲生关 系的鉴定。 3.5 微卫星分型 Genotyping 是指在对样品进行微卫星位点 PCR扩增后，利用测序技术测定个体基因型。 4 样品采集与保存 DB51/T 2649 2019 2 4.1 采样范围 需鉴定的子代及
5、其所有疑是父母。 4.2 采样工具 一次性橡胶手套、 EDTA抗凝采血管、采样登记表、采样箱、冰袋等。 4.3 血液及组织样品采集 采集小熊 猫血液样品时， 佩戴一次性橡胶手套。 动物保定 后，确认 身份信息。采用 EDTA抗凝采血管采集血液后贴上编号 ， 并立即颠倒采血管 3-5次， 放入 装有 冰袋的采样箱中。 小熊猫组织样品采集后分装，并在采样管上贴上编号，冷冻保存。 4.4 粪便样品采集 小熊猫采样前应转移到单间或转运笼中隔离，避免粪样混淆。样品需新鲜粪便。 采集样品时，应佩戴一次性 手套 ，禁止用手直接触碰粪便。 采集的样品装入无菌 采样 袋，放 入 装有 冰袋的采样箱中。 同一堆粪
6、便尽量多取样品，以 3-5团为佳。 为避免样品间的交叉污染，每次采样必须更换手套。 4.5 样品记录与编号 在 采集样品时， 填写小熊猫样品采集记录表（附录 A）。 记录采样时间、地点、动物编号、性 别、年龄、来源以及动物体况特征等。 在采血管 /采样袋和采样表上同时贴上 编号 。 4.5.1有电子芯片标记 血液样品采集编号规则 ：动物园首写字母（三位） +B（血液样品） +电子芯片号，如“ CDZ-B-756876521” 表示成都动物园血液样品，电子芯片号 756876521。 粪便样品采集编号规则 ：动物园首写字母（三位） +F（粪便样品） +电子芯片号，如“ CDZ-F-7563456
7、87” 表示成都动物园粪便样品，电子芯片号 756345687。 4.5.2无电子芯片标记 血液样品采集编号规则为：动物园首写字母（三位） +B（血液样品） +样品号或动物呼名，如 “ CDZ-B-001”表示成都动物园 001号个体的血液样品，“ CDZ-B-小黑”表示成都动物园小黑的血液样品。 粪便样品采集编号规则为：动物园首写字母（三位） +F（粪便样品） +样品号或动物呼名，如 “ CDZ-F-001”表示成都动物园 001号个体粪便样品，“ CDZ-F-小黑”表示成都动物园小黑的粪便样品。 5 DNA的提取与保存 样品采集后冷藏保存 。血液保存 温度 4， 组织和 粪便保存 温度 -
8、20 。 样 品 采集后 应 尽快 进行 DNA提取 。 5.1 样品的DNA提取 使用样品对应的专用商品试剂盒或传统分子生物学技术手段进行 DNA提取。 5.2 DNA的保存 DB51/T 2649 2019 3 近期 使用 的 DNA，装 有 DNA的离心管保存 于 -20冰箱中。 长期保存的 DNA，装 有 DNA的离心管保存 于 -80超低温冰箱中。 6 微卫星标记选用 6.1 亲子鉴定 进行小熊猫亲子鉴定时， 在 26个微卫星标记 中选择使用 （附录 B），其中 1-11号为基本标记， 12-26 号为备选标记。 当基本标记不能成功进行亲子鉴定时，考虑继续使用备选标记 。 6.2 个
9、体识别 进行小熊猫个体识别时， 在 10个微卫星标记 中选择 使用 （附录 B），其中 1-5号为基本标记， 6-10 号为备选标记。 当基本标记不能成功进行个体识别时，考虑继续使用备选标记 。 7 实验流程 7.1 DNA质量检测 使用微量分光光度计对每个 DNA样品进行浓度分析。 血液样品 260/280在 1.8-2.0之间 ， 粪便样品 260/280在 1.7-2.1之间 ， 浓度超过 50ng/ul的 DNA样品 合格。不在 范围内的 DNA样品不合格。 质量不合格的 DNA样品后续不能使用。 7.2 PCR微卫星标记 7.2.1 PCR引物的设计、合成与荧光标记 使用的 26个微
10、卫星标记的 PCR引物序列设计参见附录 B，将 序列送有关 生物 公司合成，并进行荧光标 记。详细记录引物合成的公司名称 、 合成批次及每个引物标记的 类型 ，方便后续做系统误差校正。 7.2.2 PCR扩增的反应体系和扩增程序 表1 PCR扩增的反应体系 试剂 用量 L 10PCR buffer 2.0 MgCl2(25mmol/L) 1.6 dNTP(2.5mM) 0.6 Taq polymerase(2.5U/L) 0.2 引物 -F（ 15pmol/L ） 0.4 引物 -R（ 15pmol/L ） 0.4 模板 DNA（ 20ng/L ） 2.0 ddH2O 12.8 DB51/T
11、2649 2019 4 合计 20 PCR扩增程序： 95预变性 10分钟 ； 95 变性 15秒，退火 （ 退火温度根据具体的引物确定 ） 15秒 ， 72 延伸 30秒（ 10个循环） ；然后 89 变性 15秒，退火（退火温度根据具体的引物确定） 15秒， 72 延 伸 30秒（ 25个循环 ） ； 最后 72延伸 10分钟。 PCR产物 4 保存 。 7.2.3 PCR产物的质量检测 当 PCR扩增完成后，取 PCR产物 5 L，经 1.5%-2%琼脂糖凝胶电泳检测，如电泳条带清楚、片段大小 正确，表明 PCR扩增成功； 将符合质量要求的 PCR产物避光（使用锡箔纸盒） 存放于 4冰箱
12、，用于基因分型； 对于不符合质量要求的样品， 要对样品 DNA进行纯化，并重新 进行 PCR扩增和质量检测；如果还是不 能满足要求，则需要重新采集动物血液或粪便样本进行 检测 。 7.3 微卫星分型 将 符合质量要求的 PCR产物 送 有关 实验室 进行 基因 扫描分型 。 不同 颜色 标记引物 的 PCR产物或者相同颜色标记但 PCR产物 长度明显不重叠的可以混合后进行基因 扫描分型 。 为消除系统误差，所有样品使用同一型号分型设备进行基因分型，所有批次都选用相同分子内标， 并且使用同一数据判读软件进行数据判读 。详细记录上述信息，方便后续做系统误差校正。 同一批样品 或同一地样品分两 /多
13、批次检测的，需使用一个已检测过有分型数据的样品同时进行扩 增， 进行 质量控制，以避免数据误差。 为了获得更加可信的基因型，最好 进行 多管 重复实验 。 粪便 DNA要求满足 5管 PCR重复。 7.4 微卫星分型数据的应用 7.4.1亲子鉴定 用生物学软件对微卫星位点的分型数据进行亲子鉴定 ，并根据软件说明书判断分析结果是否采信 。 对未鉴定出父本或母本的，扩大疑是父母范围，进行样品采集、 PCR扩增和基因分型，以进一步确 认。 7.4.2个体识别 用生物学软件对微 卫星位点的分型数据进行个体识别； 当两个或两个以上的样品微卫星标记分型结果完全一致时，判定样品来自同一个体； 当两个样品的微
14、卫星标记分型结果中有两个及以上标记分型结果不同时，判定样品来自不同个体； 当两个样品的微卫星标记分型结果中只有一个标记差异时，对出现差异的位点重复 PCR扩增 （ 2-3 次） 和基因分型，以进一步确认 。 重复扩增后， 若 两个样品的分型结果没有差异，则判定样品来自同一 个体 ； 若仍存在标记差异，则认为两个样品来自不同个体。 所有微卫星标记的分型数据均可用于遗传多样性评估。 8 亲子鉴定数据的管理 对圈养小熊 猫进行个体识别、亲子鉴定等 种群遗传管理 时，应统一使用 本标准规定 的分子标记 。 各保护机构 获得本 机构相关数据，并妥善保存。 DB51/T 2649 2019 5 A 附 录
15、 A （规范性附录） 小熊猫样品采集记录表 表A.1 小熊猫样品采集记录表 采样人： 采样日期： 圈舍 编号 房间 号 出生 年月 性 别 呼名 来源 样品 种类 样品编号 电子芯片 注射日期 采样量 亚种 信息 动物体况 特征 兽 1 左一 2018.3 雌 胖子 圈养 血液 CDZ-B-756876521 2019.5.10 3ml 川西 亚种 健康，尾巴少 半截 兽 2 左二 2014.7 雄 小黑 野生 粪便 CDZ-F-756345687 2018.10.15 5 团 指名 亚种 健康，左耳尖 有一撮白毛 DB51/T 2649 2019 6 B 附 录 B （规范性附录） 小熊猫微
16、卫星标记信息表 表B.1 小熊猫微卫星标记信息表 编号 标记名称 引物序列 5-3 退火温度 核心序列 长度 bp 参考文献 1 Aifu-01 F: CCTGCATCAGACTCAGCA 57 (ATAG)12 126-178 Liang et al.,2007 R: GGTATCAGACGTGGGAACTA 2 CRP267 F: ACTCTACTATGATTCTGCCTATTT 53 (TTTC)9 200-250 杨艾琳 等， 2019 R: TGAAGGTTATCTCAGGGTTT 3 Aifu-04 F: TTATTTTTTTATGGCTGAGTTA 56 (GATA)15 231
17、-255 Liang et al.,2007 R: GCACTGCTAGTTATTTACCC 4 CRP30 F: TGAGGGCATTTGATTTACC 53 (CTAT)16 370-420 杨艾琳 等， 2019 R: AGAGTGAACTGGAATGGGAG 5 Aifu-06 F: CTCTAACAGTTTCCCATT 50 (GATA)16 205-253 Liang et al.,2007 R: TGTGACCTAAACTACAGAT 6 CRP56 F: TTCCCAACTTTCTTCTCTTTC 54 (TTTA)16 290-340 杨艾琳 等， 2019 R: AACCA
18、ACCCAGTGACATCTT 7 Aifu-22 F: CACGTTGGCTTCAGTAACA 55 (TAGA)10 323-355 Liang et al.,2007 R: GGTTCGGATAAAGTATTGTGG R: CCTTGATTTGTTGGAGCATT 8 Aifu-23 F: GGACCCAACAAGCCCTTTACT 63 (TATC)13 133-161 Liang et al.,2007 R: TTCTCTCTCAGCCTCTCACCCT 9 CRP41 F: AACCTCTGTCCTCCTCCATC 56 (ATAA)13 140-190 杨艾琳 等， 2019 R
19、: GCACAATGGTTTAGGCTTTT R: ACGGGTCAGAGTCAGAGGAG 10 CRP84 F: AAGTTGAAATGCCCGAGTTG 59 (GTAA)10 350-400 杨艾琳 等， 2019 R: TTGCTGGTAGTTGTAGTAATGGTG 11 CRP240 F: TGATTCAAGGTTCCCTATGT 56 (AAAC)11 160-210 杨艾琳 等， 2019 R: AAGAAAGTGGTTAGTTTAAATGTT 12 CRP381 F: AATGTCAAGGAAGAACCCAA 54 (TCTA)12 240-290 杨艾琳 等， 2019
20、R: TTCACTGCTCACCGTTTCTA 13 Aifu-05 F: GAATAATGAGCTTGCCTTCC 57 (GATA)13 328-348 Liang et al.,2007 R: TTGACATTGGCTATGTGAACA 14 CRP335 F: GACTCTTGGTTTCAGGGTTC 55 (AAACA)9 220-270 杨艾琳 等， 2019 R: TCTACACTGGACCATTTTTGATA 15 CRP117 F: CCAAACCAAGATTCCCTC 54 (TGA)12 240-290 杨艾琳 等， 2019 R: CTTATGCTCTTTCTCCTCC
21、T DB51/T 2649 2019 7 表B.1 小熊猫微卫星标记信息表（续） 编号 标记名称 引物序列 5-3 退火温度 核心序列 长度 bp 参考文献 16 CRP442 F: TTCATGTCCTTTTGGATTGC 56 (TCAT)11 240-290 杨艾琳 等， 2019 R: CCTCTTTTACCTCTGCCTCC 17 CRP71 F: AGAGTATCTCGGAAACTGAAA 53 (TTTA)9 350-400 杨艾琳 等， 2019 R: GCATTAGGGCAAGGATTT 18 CRP35 F: TGCGGTGTATTCAGGTAAGC 58 (AAAACA)
22、9 300-350 杨艾琳 等， 2019 R: TCTTTGAACCCTCAGCCACT 19 CRP260 F: GGGGCCTTGTCTAATTCTGT 58 (GAAT)9 200-250 杨艾琳 等， 2019 R: TCACTCCTGGTGCTGGTCT 20 CRP01 F: TTTTCCTCCCATAACC 46 (TATC)10 320-370 杨艾琳 等， 2019 R: TTTGAATAGGGCAAGATA 21 Aifu-02 F: GACCCAGCCCTAACTCAAA 61 (CTAT)11 120-144 Liang et al.,2007 R: FAM-CCTG
23、CATTAGGCTCCACA 22 CRP194 F: AGTGTCTGAAAAATGGAGATGAA 55 (GAAG)10 320-370 杨艾琳 等， 2019 R:TTACCAGGTCCAAGAAGCAC 23 CRP429 F: TAGGGTTCAAGCTCTTACTTAGTC 55 (TCTA)11 200-250 杨艾琳 等， 2019 R: AGCAAACTGTTCTACCACTTCTC 24 Aifu-24 F: AGAGGGAAGTCTGCTTGAA 60 (TATC)10 225-243 Liang et al.,2007 R: CATGGCATAGTGAGCTGGT 25 CRP404 F: GTTCCCTGTAGTTTCATCCC 55 (ATTC)9 360-410 杨艾琳 等， 2019 R: TTTGTTTGCCATTGTATTCC 26 CRP367 F: TCCATGTAAGCCTCCAAACT 54 (TAGA)11 240-290 杨艾琳 等， 2019 R: AGAACCAAATGTCTCCACGT _ DB51/T 2649 2019
