1、ICS 65.020.99 B 04 备案号： DB42 湖北省 地 方 标 准 DB 42/T 1438 2018 甘薯品种真实性鉴定 ISSR 法 Verification of genuineness for sweetpotato ISSR （报批稿） 2018 - 09 - 11 发布 2018 - 12 - 10 实施 湖北省质量技术监督局 发布 DB42/T 1438 2018 I 目 次 前言 . III 1 范围 . 1 2 术语和定义 . 1 2.1 聚合酶链式反应 . 1 2.2 简单重复序列区间 . 1 2.3 引物 . 1 3 甘薯品种真实性鉴定 . 1 3.1 DN
2、A 提取 . 1 3.2 ISSR 扩增 . 1 3.2.1 反应体系 . 2 3.2.2 反应程序 . 2 3.3 PCR 产物的电泳检测 . 2 3.4 数据记录 . 2 3.5 结果分析 . 2 附录 A（资料性附录） 引物清单 . 3 附录 B（资料性附录） 湖北省主栽品种相应指纹图谱 . 4 DB42/T 1438 2018 II DB42/T 1438 2018 III 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第 1部分：标准的结构和编写给出的规则起草。 本标准由湖北省农业科学院 提出。 本标准由 湖北省农业科学院 归口管理。 本标准 起草 单位：湖北省农业科
3、学院 粮食作物 研究所。 本标准主要起草人： 杨新笋、 王连军、 雷剑 、 苏文瑾、 柴沙沙、焦春海、宋峥 。 DB42/T 1438 2018 1 甘薯品种真实性鉴定 ISSR 法 1 范围 本标准规定了 甘薯品种真实性鉴定 ISSR 法。 本标准适用于 湖北省甘薯品种和种质真实性的鉴定，包括地 方品种、选育品种、品系和国外引进种 质资源 。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 2.1 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction, PCR 是利用单链寡核苷酸引物对特异 DNA片段进行体外快速扩增的一种方法。 2.2 简单重复序列区间 inter-simple
4、 sequence repeat, ISSR 是在 PCR 技术基础上发展起来的一种分子标记和检测方法，根据某个简单重复序列（微卫星位点） 设计出一系列特异引物，通过 PCR 反应扩增微卫星位点间隔的碱基序列，以检测其扩增片段长度的多 态性。 2.3 引 物 primer 复制起始时为 DNA 聚合酶提供游离的 3羟基作为复制起点的物质，体内 DNA 复制引物一般是 RNA，有时也可以 DNA 或者蛋白质替代 ；体外引物是一段 DNA。 3 甘薯品种真实性鉴定 3.1 DNA 提取 采用 SDS 法：取甘薯种薯幼苗新鲜幼嫩叶片 0.2g 于研钵中，加液氮速冻后立即研磨成粉末。转移 粉末至预冷的
5、 1.5 mL 离心管中，加入 400L 预热至 65的 SDS 提取缓冲液（含有 2%体积的 -巯基乙 醇）、 100 L 的 10% SDS，然后 65水浴 20 min，其间轻轻颠倒混匀数次。 10000 rpm 离心 10 min。取 上清加入等体积的酚 /氯仿 /异戊醇（ 25:24:1），颠倒混匀， 10000 rpm 离心 10 min。取上清加入 2 倍体积 的无水乙醇（ -20预冷），颠倒混匀， -20放置 1 h。用带有弯钩的玻璃毛细管将絮状的 DNA 钩出来 放入 70%的乙醇中，洗涤 2 次，空气干燥 30 min。溶解在 100 L 灭菌去离子水中， -20保存。 注
6、：以上为推荐的 DNA 提取方法。其他能够达到 PCR 扩增质量要求的 DNA 提取方法都适用于本 标准。 3.2 ISSR 扩增 3.2.1 反应体系 DB42/T 1438 2018 2 模板 DNA 1L，引物 2L（ 10M）， 10 Easy Taq Buffer， dNTPs 4L（ 2.5mM）， Taq DNA Polymerase 0.5L， dd H2O补充体系至 50 L。引物清单见附录 A。 3.2.2 反应程序 94 变性 5min； 94 变性 30s， 60 复性 1 min， 72 延伸 2min，共 40个循环； 72延伸 5min， 10保存。 3.3 PC
7、R 产物的电泳检测 将适量的琼脂糖加入 1 TAE缓冲液中，加热将其溶解，配制成琼脂糖浓度为 1-3%的溶液，待冷却 至 50 -60，加入核酸染料，混匀，将其倒入制胶磨具，室温下凝固成凝胶后，放入 TAE缓冲液中 。 取 PCR扩增产物和加样缓冲液按照 5:1比例混匀，点样，其中一个泳道中加入 DNA分子量标准品，接通 电源进行电泳。以 5V/cm电压电泳，待溴酚蓝距凝胶前缘 2cm左右停止电泳。 3.4 数据记录 电泳结束后，将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪上成像，保存待测品种与对照品种的电泳图谱。 3.5 结果分析 将待测品种与对照品种的电泳图谱结果相比较，若待测品种与对照品种有显著差别，可判
8、定待测品 种与对照品种为不同品种，若待测品种与对照品种的 PCR产物一致，可以增加引物，进行检测验证，必 要时可以增加其他方法佐证 。 湖北省主栽品种相应指纹 图谱见附录 B。 DB42/T 1438 2018 3 A A 附 录 A （资料性附录） 引物清单 表 A.1所示 了 引物清单 。 表 A.1 引物清单 编号 序列 退火温度 HBAAS01 ACACACACACACACACG 55 HBAAS02 CTCTCTCTCTCTCTCTG 53 HBAAS03 ACACACACACACACACT 52.5 HBAAS04 AGAGAGAGAGAGAGAGT 52 HBAAS05 AGAG
9、AGAGAGAGAGAGC 50 HBAAS06 AGAGAGAGAGAGAGAGG 55 HBAAS07 GAGAGAGAGAGAGAGAT 50 HBAAS08 GAGAGAGAGAGAGAGAC 53 HBAAS09 CACACACACACACACAA 51.5 HBAAS10 GTGTGTGTGTGTGTGTA 52.5 HBAAS11 AGAGAGAGAGAGAGAGYC 53.5 HBAAS12 GAGAGAGAGAGAGAGAYC 51.5 HBAAS13 GTGTGTGTGTGTGTGTYC 55 HBAAS14 ACACACACACACACACYG 55 HBAAS15 AC
10、CACCACCACCACCACC 51.5 HBAAS16 ATGATGATGATGATGATG 52 DB42/T 1438 2018 4 B B 附 录 B （ 资料性 附录） 湖北省主栽品种相应指纹图谱 图 B.1 至图 B.3 分别所示了湖北省主栽品种用引物 HBAAS01、 HBAAS02、 HBAAS03 扩增的相应指纹 谱。 图 B.1 所示了湖北省主栽品种用引物 HBAAS01 扩增的 指纹图谱 。 说明： M.DNA Marker； 1.广薯菜 2 号； 2. 商薯 19； 3. 尚志 12； 4. 徐紫薯 1 号； 5. 鲁薯 3 号； 6. 徐薯 26； 7. 徐薯 43
11、-14； 8. 苏薯 10 号； 9. 苏薯 3 号； 10. 苏薯 11 号； 11.徐薯 55-2； 12. 徐紫 8008； 13. 莆薯 53； 14. 台农 71； 15. 徐 22-5； 16. 台农 66。 图 B.1 引物 HBAAS01 扩增结果 图 B.2 所示了湖北省主栽品种用引物 HBAAS02 扩增的 指纹图谱 。 说明： M.DNA Marker； 1.广薯菜 2 号； 2. 商薯 19； 3. 尚志 12； 4. 徐紫薯 1 号； 5. 鲁薯 3 号； 6. 徐薯 26； 7. 徐薯 43-14； 8. 苏薯 10 号； 9. 苏薯 3 号； 10. 苏薯 11
12、号； 11.徐薯 55-2； 12. 徐紫 8008； 13. 莆薯 53； 14. 台农 71； 15. 徐 22-5； 16. 台农 66。 图 B.2 引物 HBAAS02 扩增结果 100 250 500 750 1000 2000 100 250 500 750 1000 2000 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 1 2 1 3 14 1 5 16 M 100 250 500 750 1000 2000 100 250 500 750 1000 2000 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 M DB42/T 1438
13、 2018 5 图 B.3 所示了湖北省主栽品种用引物 HBAAS03 扩增的 指纹图谱 。 说明： M.DNA Marker； 1.广薯菜 2 号； 2. 商薯 19； 3. 尚志 12； 4. 徐紫薯 1 号； 5. 鲁薯 3 号； 6. 徐薯 26； 7. 徐薯 43-14； 8. 苏薯 10 号； 9. 苏薯 3 号； 10. 苏薯 11 号； 11.徐薯 55-2； 12. 徐紫 8008； 13. 莆薯 53； 14. 台农 71； 15. 徐 22-5； 16. 台农 66。 图 B.3 引物 HBAAS03 扩增结果 100 250 500 750 1000 2000 100 250 500 750 1000 2000 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 12 13 1 4 15 16 M
