1、 ICS 13.310 A 92 中 华 人 民 共 和 国 公 共 安 全 行 业 标 准 GA GA/T 代替 GA/T 121-1995 法庭科学 生物检材 中 斑蝥素 检验 气相色谱 -质谱 和液相色谱 -质谱 法 Forensic sciences Examination methods for cantharidin in biological samples GC and GC-MS - -发布 - -实施 中华人民共和国公安部 发布 GA/T 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准代替 GA/T 121-1995中毒检材中斑蝥素的定性定量分析方
2、法 ，与 GA/T 121-1995 相比， 除编辑性修改外主要技术变化如下 ： 修改了标准名称 （见封面， 1995 年版封面） ； 删除了 气相色谱检验法（见 1995 年版 第一篇 ）； 删除了薄层色谱检验方法（见 1995 年版第二篇）； 修改了仪器和材料有关内容（见第 5 章 和第 6 章 ，见 1995 年版第 5 章）； 增加了气相色谱 -质谱检验方法（见 第 7 章 ）； 增加了液相色谱 -串联质谱检验方法 （见 第 7 章 ） 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技术委员会（ S
3、AC/TC 179/SC 1）提出并归口。 本标准起草单位：公安部物证鉴定中心 、山西医科大学 、 司法部司法鉴定科学技术研究所 。 本标准起草人： 黄健 、 张蕾萍 、 杜鸿雁、 栾玉静、董颖、张云峰、 王芳琳、 于忠山 、 贠克明、王玉 瑾、 刘伟 。 GA/T 1 法庭科学 生物检材中 斑蝥素 检验 气相色谱 -质谱和液相色谱 -质谱 方法 1 范围 本标准规定了 法庭科学 生物 检材 （ 血 、尿 、肝、肾 、胃及胃内容等） 中 斑蝥素 的气相色谱 -质谱（ GC-MS） 和液相色谱 -质谱 (LC-MS)定性定量 检验方法。 本标准适用于 法庭科学 生物 检材 中 斑蝥素 的定性 分
4、析 和 定量 分析 。 其他可疑 样 品中 斑蝥素 的定性分 析和定量分析可参照使用。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本文件。 4 原理 以空白样品和添加样品 作对照，按平行操作的要求， 对 生物 检材 进行 提取、净化及浓缩后， 采用气 相色谱 -质谱法和液相色谱 -质谱法定性定量 ，以保留时间 、 质谱
5、特征离子碎片峰 和 相对丰度 比 作为定性 判断依据； 以 峰面积 为依据 ， 采用 外标法进行定量分析。 5 试剂 和 材料 5.1 试剂 气相色谱 -质谱实验用水应符合 GB/T 6682 中规定的三级水，液相色谱 -串联质谱实验用水应符合 GB/T 6682 中规定的一级水。除非另有说明，在分析中使用的试剂均 为分析纯，试剂包括： a) 二氯甲烷 ； b) 乙酸乙酯 ； c) 盐酸； d) 甲醇 （色谱纯）； e) 乙腈 （色谱纯）； h) 甲酸 （色谱纯） ； f) 甲酸 /甲酸铵缓冲液（ pH值 3.5）：量取 3.77mL甲酸、称取 6.30g甲酸铵，加入去离子水振荡至 溶解，定容
6、至 1000mL，混匀； g) 标准 溶液 ： GA/T 2 1) 1.0mg/mL 标准物质溶液：根据斑蝥素标准物质的纯度， 称取适量， 用甲醇配制 1.0mg/mL 斑蝥素标准物质溶液，置于冰箱中冷藏保存。有效期 6 个月。或采用市售 标准溶液 ； 2) 0.1mg/mL标准工作溶液：移取 1.0mg/mL的斑蝥素标准物质溶液 1.0mL，用甲醇定容 至 10mL，混匀，密封，置于冰箱中冷藏保存，有效期 3个月。实验中所用其 他 浓度的混 合标准工作溶液均由 0.1mg/mL标准物质溶液用甲醇稀释得到 。 注： 特殊情况下可使用对照溶液代替标准溶液。 5.2 材料 材料包括有： a) 具盖
7、离心管； b) 具塞玻璃试管； c) pH 试纸 ： 范围 114； d) 固相萃取柱： Oasis HLB 柱或等效固相萃取柱 ： 依次以甲醇、水活化 ； 注 ： Oasis HLB 柱是 Waters 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产 品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等 效产品 。 e) 有机系 微孔滤膜： 0.22m。 6 仪器和设备 仪器和设备包括： a) 气相色谱 -质谱仪：配有电子轰击源（ EI）； b) 液相色谱 -质谱仪 ： 配有电喷雾离子源（ ESI）和三重四极杆质量分析器 ； c) 电子天平； d) 移液器；
8、e) 超声 波清洗器 ； f) 振荡器； g) 离心机； h) 浓缩仪 。 7 操作方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品 提取 7.1.1.1 液液萃取 取血液、尿液等液体 检材 样品 1.0mL 2.0mL，或 称 取 铰碎 的 肝脏等 固体检材 样品 1.0g 2.0g于具盖 离心管中 ， 加入 甲酸 /甲酸铵缓冲液 调 pH至 3 4，振荡 ，再加入 二氯甲烷或乙酸乙酯 3mL 5mL，振荡 10min， 8000r/min离心 10min， 分离有机相 ；重复提取一次 ，分离合并两次 提取的 有机相，置于浓缩 器 上 50浓缩至干 。残 留 物用 甲醇 50L 100L溶解 ， 作
9、为检材样品提取液供 GC-MS分析或 用甲醇 500 L 溶解，经 0.22m的有机系微孔滤膜过滤，供 LC-MS分析。 7.1.1.2 固相萃取 (适 用 于新鲜样品 ) GA/T 3 取血液等液体 检材 样品 1.0mL 2.0mL，或 称取铰 碎的 肝脏等固体检材 样品 1.0g 2.0g，加入 1%盐 酸溶液 4mL 8mL于具盖离心管中 ， 混旋，超 声 15min， 8000r/min离心 20min，取上清液 转移至已活化 好的固相萃取柱中， 控制上清液过柱 流速为 0.5mL/min 1.0mL/min；再 用 水 6mL淋洗后 ， 弃去淋洗液 ， 挤干水分或离心或真空抽固相萃
10、取柱 2min， 用 甲醇 4mL洗脱，收集洗脱液置于 浓缩器上 40浓缩至干 ， 残 留 物 用 甲醇 50L 100L溶解 , 作为检材样品提取液供 GC-MS分析或用 0.22m的有机系微孔滤膜过 滤，供 LC-MS分析。 7.1.1.3 质控样品制备 取 等量相 似 基质的 空白样品 （若 无相似 基质空白 样品可用血液替代） 两 份 于具盖离 心管中 ，一份 作 为空白样品，一份添加斑蝥素标准物质，作为添加样品（ GC-MS添加样品的浓度为 1g/mL(g)， LC-MS 添加样品的浓度为 10ng/mL(g)）， 与检材样品平行操作，得到 空白样品提取液和添加样品提取液供仪器 分析
11、 。 7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 仪器条件 7.1.2.1.1 气相色谱 -质谱 条件 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整 ： a) 色谱柱： DB-5MS 柱（ 30m0.32mm0.25m）或等效色谱柱； 注： DB-5MS 柱 是 Aglient 公司产品的商品 名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品 的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 色谱柱温程： 100保持 2min，以 15/min 速率升温至 280，保持 17min； c) 进样口温度： 280； d) 传输线温度： 230； e)
12、 离子源温度： 200； f) 载气：高纯氦气； g) 柱流量： 1mL/min 2mL/min； h) 分流比： 5:1 50:1； i) 质量扫描范围： 40amu 450amu； j) 扫描方式：全扫描 （ Scan） ， 定量离子： m/z: 128，定性离子： m/z: 96。 7.1.2.1.2 液相色谱 -质谱 条件 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整： a) 色谱柱： ZORBAX Eclipse Plus C18(2.1 mm100mm,1.8m)柱或等效色谱柱； 注： ZORBAX Eclipse Plus C18 柱 是 Aglient 公司产
13、品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不 是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 流动相 及梯度洗脱条件 ： 见表 1； 表 1 流动相和梯度洗脱条件 时间 min 流速 mL/min 流动相 A （ 0.1%甲酸水） 流动相 B （乙腈） 0.1 0.4 90% 10% 1.0 0.4 10% 90% 2.0 0.4 10% 90% GA/T 4 2.1 0.4 90% 10% 4.2 0.4 90% 10% c) 离子源 ： 电喷雾电离源 （ ESI） ； d) 检测方式：正离子； e) 检测方式：多反应 离子 监测 （ MRM）
14、 ； f) 电喷雾电压： 5500 KV； g) 离子源温度： 650； h) 雾化气压力： 55psi； i) 气帘气压力： 30psi； j) 辅助气压力： 50psi； k) MS 参考条件（检测离子对、去簇电压、碰撞能量 等 ） 见表 2。 表 2 MS 参考条件 名称 保留时间 min 定量离子对 定性离子对 去簇 电压 V 碰撞能量 eV 斑蝥素 1.47 197.1 123.1 197.1 123.1 110 20 197.1 107.0 110 16 7.1.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液及标准工作溶液，按 7.1.2.1 的分析条件进样分析 。 7.2 定量
15、分析 7.2.1 样品 提取 移取血液等液 体检材 样品 1.0mL 2.0mL， 或称取铰碎的 肝脏等 固 体检材 样品 1.0g 2.0g两份 ， 按 7.1.1进行操作。 另取等量 相似 基质的空白样品 三 份， 其中 两份分别添加 斑蝥素 标准 物质 作为添加样品 （ 添加样品中 目标物含量应为检材 样品 中目标物含量的 (10050)% ），另一份 作为空白样品，与检材 样品平行 操作 ， 得到 空白样品提取液和添加样品提取液供仪器 分析 。 7.2.2 仪器检测 7.2.2.1 仪器条件 按 7.1.2.1规定的条件分析。 7.2.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液
16、及 标准工作 溶液，按 7.1.2.1 的 分析条件每个样品进样分析 2 3 次。若要报告测量不确定度，每个样品分析次数应不少于 6 次。 7.2.3 计算 7.2.3.1 计算含量 记录各样品提取液平行进样 2 3 次 的 目标物保留时间和峰面积值，按公式（ 1）计算含量： GA/T 5 添样添 样添样 VMA VMAW = . (1) 式中： W 检材样品 中目标物的含量，单位为微克每克 （ g/g） 或微克每毫升（ g/mL） ； A 样 检材 样品提取液 中目标物峰面积平均值； M 添 添加样品中 目标物 添加量，单位为微克 （ g ） ； V 样 检材 样品 的定容体 积，单位为毫升
17、 （ mL） ； A 添 添加样品 提取液 中目标物峰面积平均值； M 样 检材 样品 的取样量，单位为克 （ g） 或毫升 （ mL） ； V 添 添加样品的定容体积，单位为毫升 （ mL） 。 7.2.3.2 计算相对相差 记录 两 份平行操作的 检材 样品中目标物的 含量，按公式（ 2）计算相对相差： %10021 = X XXRD . (2) 式中： RD 相对相差 ， 用百分比（ %）表示 ； X1、 X2 两个检材 样品 平行定量测定的含量数值； X 两个检材 样品 平行定量测定含量的平均 值。 8 结果评价 8.1 定性结果评价 8.1.1 气相色谱 -质谱 阳性结果评价：在相同
18、条件下进行样品测定时，检材样品中目标物的色谱峰保留时间与标准溶液一 致（相对误差在 1%之内），且在扣除背景后的检材样品质谱图中，目标物的质谱特征离子（不少于 3 个）与标准溶液一致，特征离子丰度比与浓度接近的标准溶液相比，相对偏差不超过表 3 规定的范围， 空白样品无干扰，则可判断检材样品中检出目标物。 表 3 特征离子丰度比的最大允许相对偏差范围 特征离子丰度比 50% 20 50 10 20 10% 最大允许相对偏差 10 15 20% 50% 阴性结果评价：检材样品未出现与目标物标准溶液一致的色谱峰，且添加样品中出现与目标物标准 溶液一致的色谱峰，空白样品无干扰，则可判断检材样品中未检
19、出目标物。 方法检出限参加附录 A。 8.1.2 液相色谱 -质谱 阳性结果评价：在相同条件下进行样品测定时，检材样品中目标物的色谱峰保留时间与标准溶液一 致（相对误差在 2.5%之内）、目标物的定性离子（至少两对定性离子）与标准溶液一致，且离子丰度 比与浓度接近的标准溶液相比，相对偏差不超过表 4规定的范围，空白样 品无干扰，则可判断检材样品 中检出目标物。 GA/T 6 表 4 离子丰度比的最大允许相对偏差范围 离子丰度比 50% 20 50 10 20 10% 最大允许相对偏差 20 25 30% 50% 阴性结果评价：检材样品未出现与目标物标准溶液一致的色谱峰，且添加样品中出现与目标物
20、标准 溶液一致的色谱峰，空白样品无干扰，则可判断检材样品中未检出目标物。 方法检出限参 见 附录 A。 8.2 定量结果评价 如果目标物含量的 RD 20%，定量数据可靠，其含量按两份检材的平均值计算。如果检材样品中 目标物含量 的 RD 20%，定量数据不可靠。应按 7.2重新提取检验。 斑蝥素 的 理化性质 和相关谱图参见附录 A。 GA/T 7 附 录 A （资料性附录） 斑蝥素的 检出限、 理化性质 和 相关谱图 A.1 方法检出限 LC-MS分析，检 出 限为 10ng/mL（ g）。 GC-MS分析检 出 限为 1g/ mL（ g）。 A.2 斑蝥素 的 理化性质 斑蝥素 来源于
21、昆虫 南方大斑蝥 或黄黑小斑蝥 干燥虫体 。 斑蝥素 分子结构见图 A.1， 分子式： C10H12O4， 分子量： 196.202，化学名：六氢 -3a,7a-二甲基 -4,7-氧桥异苯并呋喃 -1,3-二酮。 斑蝥素 为具有反光的鳞片 状结晶，无色，无臭，不溶于冷水，溶于丙酮、乙醇、乙醚、氯仿、乙酸乙酯。动物实验表明， LD50 （小鼠） 2.1mg/kg。 斑蝥素 在中药中为辛、寒、 有毒之品，具有破血散结功能，毒性较大，主要表现为泌尿系统及消 化道的刺激作用。 如果滥用、超量应用、与酒蒜同用、生用 (或泡制不当 )、外用面积过大、冲服会引起 中毒 。 图 A.1 斑蝥素分子结 构 A.
22、3 斑蝥素的 相关谱图 斑蝥素的相关谱图 见图 A.2图 A.4。 图 A.2 斑蝥素 的气相色谱质谱 总离子流图 GA/T 8 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 0 100 % 96 128 41 70 143 256 386171 281 353 494207 535415237 316 450 图 A.3 斑蝥素 的 质谱图 图 A.4 斑蝥素 的 液相色谱质谱 提取离子流图 A.4 斑蝥素的相关数据 血液样品中斑蝥素检出限 见表 A.1。 表 A.1 血液样品中斑蝥素检出限 单位为纳克每毫升 （ ng/mL） 斑蝥素 GC-MS LC-MS/MS 血液 100 10 _
