1、 ICS 13.310 A 92 中 华 人 民 共 和 国 公 共 安 全 行 业 标 准 GA GA/T 法庭科学 生物 检材 中 美沙酮检验 液相色谱 -质谱法 Forensic sciences Examination methods for methadone in biological samples LC-MS - - 发布 - -实施 中华人民共和国公安部 发布 GA/T I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技术委员
2、会（ SAC/TC 179/SC 1） 提出并 归口。 本标准由 起草单位： 公安部物证鉴定中心 、 济南市 公安 局 刑事技术科学研究所 。 本标准起草人： 栾玉静 、 王瑞花 、 董颖 、 王爱华、 任昕昕、 王芳琳 、 常靖 、 宋歌、 董林沛 、 武继锋、 宋蕊 。 GA/T 1 法庭科学 生物检材 中 美沙酮 检验 液相色谱 -质谱法 1 范围 本标准规定了 法庭科学 生物检材 （ 血、尿、肝、肾、胃及胃内容等 ） 中美沙酮 的液相色谱 -质谱 （ LC-MS） 检验方法。 本标准适用 于 法庭科学 生物检材中美沙酮的定性 分析和 定量 分析 。 其他 可疑 样品 中美沙酮的 定性分
3、 析和定量分析可参照使用 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方 法 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本文件。 4 原理 以空白样品和添加样品作对照，按平行操作的要求，对生物检材进行提取、净化及浓缩，采用液相 色谱 -质谱法检测，以保留时间、质谱特征离子碎片峰和相对丰度 比 作为定性判断依据；以峰面积为依 据，采用外标法进行定量分析。 5 试剂
4、和 材料 5.1 试剂 实验用水应符合 GB/T 6682 中规定的一级水， 除非另有说明，在分析中使用的试剂均为分析纯， 试 剂包括： a) 甲醇 （色谱纯） ； b) 乙腈 （色谱纯） ； c) 0.1mol/LHCl 溶液 ： 移 取 浓盐酸 8.3mL，加水稀释至 1000mL； d) 5mmol/L 甲酸 铵 溶液 （ pH 值 3.5） ： 称取甲酸铵 0.315g，加水溶解 并 稀释至 1000mL，用甲酸 调 pH 值为 3.5； e) 氨水 ； f) 标准 溶液 ： 1） 1.0mg/mL 标准 物质溶 液： 根据美沙酮标准物质纯度和盐型换算后， 称取适量， 用甲醇配 制 1
5、.0mg/mL 美沙酮 标准物质溶液，置于冰箱中冷藏保存。有效期 6 个月。或采用市售 标准溶液； GA/T 2 2） 10.0g/mL 标准 工作溶液 ： 移取 1.0mg/mL 标准物质溶液 0.1mL， 用甲醇 稀释至 10mL，混 匀 ， 密封，置于冰箱中冷藏保存 。有效期 3 个月 。 实验中所用 其他 浓度的标准工作溶液均 由 1.0mg/mL 标准物质溶液用甲醇稀释得到。 注： 特殊情况下可使用对照溶液代替标准溶液 。 5.2 材料 材料 包括 ： a) 具盖离心管； b) 具塞玻璃试管； c) 有机 系 微孔滤膜： 0.22m； d) 混合型阳离子交换（ Oasis MCX）固
6、相萃取柱 或其他等效固相萃取柱，依次用 1mL 甲醇， 1mL 水活化 。 注： Oasis MCX 固相萃取柱是 Waters 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表 示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 6 仪器和设备 仪器和设备包括： a) 液相色谱 -质谱仪：配电喷雾离子源（ ESI）和三重四极杆或离子阱质量分析器； b) 电子天平； c) 离心机； d) 振荡器； e) 移液器。 7 操作方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品 提取 7.1.1.1 固相萃取 移取血液等液体 检材 样品 1.0mL 2.0mL，或称取铰
7、碎的肝脏等固体 检材 样品 1.0g 2.0g于具盖离心 管中。 加入 0.1mol/L HCl溶液 4.0mL， 混匀， 8000r/min离心 20min， 取上清液转移至已活化好的 固相萃取 柱中 ， 控制流速为 1mL/min， 依次 用 水 1mL、 甲醇 1mL、乙腈 1mL淋洗 ， 挤干水 分 或离心或真空抽固相 萃取柱 2min， 用 氨水 /乙腈 （体积比 5:95）混合 溶 液 1mL洗脱， 收集洗脱液置于浓缩器上 50下浓缩至干， 残留物用 初始流动相 1.0mL溶解 ，经有机 系 微孔滤膜过滤，供仪器分析。 7.1.1.2 质控 样品制备 取等量 相似 基质的空白样品（
8、若无法取到 相似 基质样品可用血液替代）两份于具盖离心管中，一份 作为空白样品，一份添加 美沙酮 标准物质 ， 作为添加样品 （添加样品的浓度为 20ng/mL） ， 与检材平行 操作 , 得到空白样品提取液和添加样品提取液供 仪器 分析 。 7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 仪器条件 7.1.2.1.1 液相色谱 -质谱仪（离子阱质量分析器）条件 GA/T 3 以下为参考 条件 ， 可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整： a) 色谱柱： C18色谱柱（ 2.1mm150mm， 3.5m）或 其他 等效柱 ； b) 流动相 ： A：乙腈 ， B： 5mmol/L甲酸铵溶液（ pH
9、值 3.5） ； c) 洗脱方式：梯度洗脱 条件 见表 1； 表 1 梯度洗脱条件 时间 min A B - 10% 90% 3.0 90% 10% 8.0 90% 10% 11.0 10% 90% 19.0 10% 90% d) 进样量： 10L； e) 柱温： 30； f) 流速： 0.3mL/min； g) 离子化模式： ESI+； h) 扫描方式： 正离子扫描 ， 采用二级全扫，母离子 M+H+=310.2， 定量 子离子 m/z=264.9； i) 鞘气（氮气）： 30arb； j) 辅助气（氮气）： 10arb； k) 喷雾电压： 4.5kV； l) 毛细管电压： 4.0V； m)
10、 毛细管温度： 290； n) 相对碰撞能： 35%。 7.1.2.1.2 液相色谱 -质谱仪（三重四级杆质量分析器） 条件 以下为参考 条件 ， 可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整： a) 色谱柱： ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱 (2.1mm50mm,1.7m)或 其他 等效柱 ； 注： ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱为 Waters 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者， 并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 流动相 ： A： 乙腈 ， B： 5mmol/L甲酸铵溶液（ pH
11、值 3.5） ； c) 洗脱方式：梯度洗脱 条件 见表 2； 表 2 梯度洗脱条件 时间 min A B - 10% 90% 1.5 60% 40% 1.8 60% 40% 2.0 10% 90% 3.5 10% 90% d) 柱温： 35； GA/T 4 e) 流速： 0.6mL/min； f) 离子源：电喷雾电离（ ESI）； g) 检测方式：正离子 ； h) 毛细管电压： 2.8kV； i) 源温度： 150； j) 雾化气流速： 1000L/h； k) 扫描模式：多反应离子监测（ MRM）； l) MS参考条件 （ 定量离子对、去簇电压、碰撞能 ） ： 见表 3。 表 3 MS 参考条
12、件 中文名称 定量离子 对 定性离子 去簇 电压 V 碰撞能量 eV 美沙酮 310.31 105.04 310.31 105.04 24 28 310.31 265.18 14 7.1.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液及标准工作溶液 ，按 7.1.2.1 分析条件进样分析。 7.2 定量分析 7.2.1 样品 提取 移取血液等液体 检材 样品 1.0mL 5.0mL，或称取铰碎的 肝脏等固体 检材 样品 1.0g 5.0g两份 ，按 7.1.1进行操作。 另取等量相 相似 基质的空白样品 三 份， 其中两份 添加美沙酮标准物质 作为添加样品 （添加样品中目 标物含量应为检材样
13、品中目标物含量的 (100 50)% ） ， 另一份作为空白样品 ，与检材平行操作 ， 得到 空白样品提取液和添加样品提取液供仪器 检测。 7.2.2 仪器检测 7.2.2.1 仪器条件 按 7.1.2.1 规定的 条件分析 。 7.2.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液 及 标准工作溶液 ，按 7.1.2.1.2 的 分析条件每个样品进样分析 2 3 次。若要报告测量不确定度，每个样品分析次数应不少于 6 次 。 7.2.3 计算 7.2.3.1 计算含量 记录各样品 提取液 平行进样 2 3 次的 目标物 保留时间和 峰面积值，按公式（ 1）计算含量： 添样添 样添样 VMA
14、 VMAW = . (1) 式中： W 检材 样品中目标物质的含量，单位为微克每克（ g/g）或微克每毫升（ g/mL）； GA/T 5 A 样 检材 样品 提取液 中目标物峰面积平均值； M 添 添加样品中标准物质添加量，单位为微克（ g）； V 样 检材 样品的定容体积，单位为毫升（ mL）； A 添 添加样品 提取液 中目标物峰面积平均值； M 样 检材 样品的取样量，单位为克（ g）或毫升（ mL）； V 添 添加样品的定容体积，单位为毫升（ mL）。 7.2.3.2 计算 相对相差 记录两份平行操作的检材样品 中目标物的 含量，按公式（ 2）计算相对相差： %1 0 021 = X
15、XXRD . (2) 式中： RD 相对相差 ，用百分比 （ %） 表示 ； X1、 X2两 份 样品平行定量测定的含量数值； X 两 份 样品平行 定量测定含量的平均值。 8 结果评价 8.1 定性结果评价 8.1.1 阳性结果评价 在相同条件下进行样品测定时，检材样品中目标物的色谱峰保留时间与标准溶液一致（相对误差在 2.5%之内）、目标物的定性离子（至少两对定性离子）与标准溶液一致，且离子丰度比与浓度接近的 标准溶液相比，相对偏差不超过表 4 规定的范围，空白样品无干扰，则可判断检材样品中检出目标物。 表 4 离子丰度比的最大允许 相对偏差范围 相对离子丰度 50% 20% 50% 10
16、% 20% 10% 最大允许 相对偏差 20% 25% 30% 50% 8.1.2 阴性结果评价 检材样品未出现与目标物标准溶液一致的色谱峰，且添加样品中出现与目标物标准溶液一致的色谱 峰，空白样品无干扰，则可判断检材样品中未检出目标物。 美沙酮相关总离子流图和二级质谱图参见附 录 A中图 A.1、图 A.2。 本方法美沙酮的检 出限 参见附录 A。 8.2 定量结果评价 如果检材样品中目标物含量的 RD 20%，定量数据可靠，其含量按两份检材样品的平均值计 算。 如果检材样品中目标物含量的 RD20%，定量数据不可靠。应按 7.2重新提取检验 。 美沙酮的中毒诊断参考资料 参 见 附录 B。
17、 GA/T 6 附 录 A （资料性附录） 美沙酮 的 相关 图谱 美沙酮的色谱质谱图 见图 A.1、 图 A.2。 本方法美沙酮的检出限为 20ng/mL。 R T : 0 . 0 0 - 1 4 . 0 2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 T i m e (m i n ) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 R e la tive Ab u n d a n ce 8 . 0 7 8 . 3 3 8 . 7 1 9 . 6 4 1 0 . 0 2 1 0 . 9 8
18、1 1 . 7 0 1 2 . 4 77 . 9 31 . 9 11 . 2 5 2 . 5 7 6 . 5 4 1 3 . 2 50 . 4 1 3 . 4 6 4 . 3 1 7 . 1 94 . 7 8 5 . 6 3 N L : 1 . 5 8 E7 T I C F : + c ESI SR M m s 2 3 1 0 . 0 0 3 5 . 0 0 2 6 4 . 5 0 -2 6 5 . 5 0 , 3 0 9 . 5 0 -3 1 0 . 5 0 M S 100ngdif ennuoz hi- M S T 100ngdif ennuoz hi- M S T # 5 0 7 -5
19、2 4 R T : 7 . 9 3 -8 . 1 5 AV: 6 NL: 5 . 7 3 E6 F: + c ESI SR M m s 2 3 1 0 . 0 0 3 5 . 0 0 2 6 4 . 5 0 -2 6 5 . 5 0 , 3 0 9 . 5 0 -3 1 0 . 5 0 265 270 275 280 285 290 295 300 305 310 m / z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 R e la ti ve Ab u n d a n ce 2 6 4 . 9 6 3 1 0 .
20、 2 4 图 A.1 美沙酮 的 HPLC-MS色谱质谱图 24-A u g -201219: 28: 32st-100n g / ml T i m e 0 .5 0 1 .0 0 1 .5 0 2 .0 0 2 .5 0 3 .0 0 % 0 100 0 .5 0 1 .0 0 1 .5 0 2 .0 0 2 .5 0 3 .0 0 % 0 100 20120824- 119 M RM o f 4 Ch a n n e l s ES+ 3 1 0 .3 0 6 2 6 5 .1 8 (M e h a d o n e ) 4 .9 3 e 6 1 .4 3 20120824- 119 M RM
21、 o f 4 Ch a n n e l s ES+ 3 1 0 .3 0 6 1 0 5 .0 3 5 (M e h a d o n e ) 2 .2 1 e 6 1 .4 3 图 A.2 美沙酮的 UPLC-MS 色谱质谱 图 GA/T 7 附 录 B （资料性附录） 美沙酮 的 中毒诊断参考资料 B.1 理化性质 本品为无色结晶或白色结晶性粉末，溶于水，易溶于乙醇，几乎不溶于乙醚。 m.p.=230 234。 本品游 离碱的 pKa（ HB+）为 8.3， 1%的水溶液 pH=4.5 6.5， 水溶液不稳定，在光照下变色。 B.2 中毒症状 过量服用药物 ， 可引起呼吸困难或变浅，极度疲劳或嗜睡、视力模糊、思维迟钝、语言行为异常， 晕厥、头晕、意识混乱， 中度中毒者 可出现神志不清，呼之不应，四肢及口唇发绀，皮肤湿冷，体温下 降，血压逐渐下降，呼吸变慢，平均每分钟 8 10 次，瞳孔显针尖样缩小，严重者出现潮式呼吸，甚至 呼吸麻痹而致死亡。 B.3 中毒死亡机理 美沙酮为阿片类受体激动剂，主要作用于 受体 。美沙酮通过降低呼吸中枢对二氧化碳张力的敏感 性 和抑制桥脑呼吸调节中枢，产生中枢性呼吸抑制作用，至呼吸麻痹而死亡。 B.4 美沙酮 的 中毒浓度 美沙酮的中毒血药浓度为 2.0mg/L，致死血药浓度 大于 4.0mg/L。 _
