1、 ICS 13.310 A 92 中 华人民 共和国 公共安 全行业 标准 GA GA/T 法庭科学 生物 检材 中佐匹克隆和右佐匹 克隆 检验 液相色谱 -质谱 法 Forensic sciences Examination methods for zopiclone and eszopiclone in biological samples LC-MS - - 发布 - -实施 中华人民共和国公安部 发布 GA/T I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国刑事技术标
2、准化技术委员会毒物分析分技术委员会（ SAC/TC 179/SC 1）提出并归口。 本标准起草单位：公安部物证鉴定中心 、北京市公安局法医检验鉴定中心 、山西山西医科大学 。 本标准 主要 起草人：张蕾萍、 任昕昕、王爱华、宋歌、董林沛、 于忠山、何毅、王芳琳 、乔静、杨 士云、张文芳 、贠克明、王玉瑾、尉志文。 GA/T 1 法庭科学 生物检材中佐匹克隆和右佐匹克隆检验 液相色谱 -质谱法 1 范围 本标准规定了 法庭科学 生物检材 （血、尿、肝、肾 、胃及胃内容 等）中 佐匹克隆和右佐匹克隆的液 相色谱 -质谱（ LC-MS） 定性定量 检验方法。 本标准适用于 法庭科学 生物检材 中佐匹
3、克隆和右佐匹克隆的定性 分析和定量分析 。 其他 可疑 样 品中 佐匹克隆和右佐匹克隆的定性 分析 和定量分析可参照使用 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅 注日期的版本适用于本文件。 凡是不注 日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本文件。 4 原理 以空白样品和添加样品作对照，按平行操作的要求 ， 对 生物检材进行提取、净化及浓缩，采用液相 色谱 -质谱法 定性定量 ，以保留
4、时间、质谱特征离子碎片峰和相对丰度 比 作为定性判断依据；以峰面积 为依据，采用外标法进行定量分析。 5 试剂 和 材料 5.1 试剂 实 验用水 应符合 GB/T 6682 中 规定 的一级水 。除非另有说 明，在分析中使用的试剂均为分析纯， 试 剂包括 ： a) 二氯甲烷； b) 磷酸二氢钠 ； c) 磷酸氢二钠； d) 氨水； e) 甲醇 （ 色谱纯 ） ； f) 乙腈 （ 色谱纯 ） ； g) 二乙胺 （ 色谱纯 ） ； GA/T 2 h) 异丙醇 （ 色谱纯 ） ； i) 乙 酸铵 （ 色谱纯 ） ； j) 甲酸 （ 色谱纯 ） ； k) 乙酸乙酯 （ 色谱纯 ） ； l) 环已烷
5、（ 色谱纯 ） ； m) pH 值 7.4 磷酸盐缓冲液：称取磷酸氢二钠（ Na2HPO42H2O） 2.88g 和磷酸二氢钠（ NaH2PO4H 2O） 0.52g， 加入一定量的 水溶解并 稀释至 100mL； n) 0.1%甲酸 5mmol/L 乙酸铵溶液：称取乙酸铵（ CH3COONH4） 0.192g，加入一定量 的水溶解， 并加入 0.5mL 甲酸，混匀，加水稀释至 500mL； o) 0.1%二乙胺 /乙腈溶液： 移取 1.0mL二乙胺，加入乙腈稀释至 1000mL； p) 0.1%二乙胺 /异丙醇溶液： 移取 1.0mL二乙胺，加入异丙醇稀释至 1000mL； q) 标准溶液：
6、 1） 1.0mg/mL 标准 物质溶 液： 根据 佐匹克隆和右佐匹克隆 标准物质的纯度 和盐型换算后 ， 各 称取适量， 分别用 甲醇 配制 1.0mg/mL 佐匹克隆和右佐匹克隆标 准物质溶液 ， 置于冰箱中 冷藏保存 ， 有效期 2 个月 。 或采用市售标准溶液 ； 2） 10.0g/mL 佐匹克隆和右佐匹克隆 单一标准工作溶液： 分别 移取 1.0mg/mL 的 佐匹克隆和 右佐匹克隆 标准物质溶液各 0.1mL，用甲醇稀释至 10mL，混匀，配制成浓度为 10.0g/mL 的单一标准工作溶液，密封，置于冰箱中冷藏保存，有效期 1 个月。实验中所用 其他 浓度 的单一标准工作溶液均由
7、1.0mg/mL 标准物质溶液用甲醇稀释得到； 3） 0.1mg/mL 混合标准工作溶液： 分别 移取 1.0mg/mL 的 佐匹克隆和右佐匹克隆 标准物质溶 液各 1.0mL，用甲醇定容至 10mL，混匀，密封，置于冰箱中冷藏保存，有效期 1 个月。 实验中所用 其他 浓度的混合标准工作溶液均由 1.0mg/mL 标准物质溶液用 甲醇稀释得到。 注 ： 特殊情况下可使用对照溶液替代标准溶液 。 5.2 材料 材料包括： a) 具 盖 离心管 ； b) pH试纸：范围 1 14； c) 有机 系 微孔滤膜： 0.22m； d) 固相萃取柱： Oasis HLB柱或等效固相萃取柱 。 注： Oa
8、sis HLB柱是 Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品 的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 6 仪器和设备 仪器和 设备 包括： a) 液相色谱 -质谱仪 ： 配电喷雾离子源（ ESI）和三重四极杆质量 分析器 ； b) 凝胶渗透色谱仪 ： 配紫外检测器 ； c) 电子天平 ； d) 离心机； e) 振荡器； f) 浓缩 器 ； g) 移液器 。 7 操作方法 GA/T 3 7.1 定性分析 7.1.1 样品 提取 7.1.1.1 液液 萃取 移取血液等液体 检材 样品 1.0mL 2.0mL，或称取绞碎的肝脏等
9、固体 检材 样品 1.0g 2.0g于具盖离心 管中， 加入乙酸乙酯或二氯甲烷 5.0mL 10.0mL，振荡 10min， 8000r/min离心 10min， 分离 有机相 ， 重 复提取一次，合并两次提取的有机相， 置于 浓缩器上 50下浓缩至干， 残留物 用 初始流动相 200L 1000L溶解 ， 经 有机 系 微孔 滤膜过滤 ， 供仪器分析。 7.1.1.2 固相萃取 （适用于新鲜血液） 移取血液 检材 样品 1.0mL 2.0 mL，于具盖离心管中 ， 加入 pH值 7.4的 磷酸 盐 缓冲液 5.0mL 10.0mL， 混匀 ，超声 15min， 8000r/min离心 20m
10、in， 取上清液转移至已活化好的固相萃取柱中 ， 控制 上清液 流速 为 0.5mL/min 1.0mL/min，依次 用 3mL水和 3mL氨水 /甲醇 （ 体积比 0.5:99.5）混合溶液 淋洗 ， 用 4mL二 氯甲烷洗脱， 收集洗脱液 ，置于 浓缩器上 50下浓缩至干， 残留物 用 初始流动相 200L 1000L溶解 ， 经有机 系 微孔滤膜过滤， 供仪器分析。 7.1.1.3 质控 样品制备 取 等量相 似 基质的 空白样品 （若 无相似 基质空白 样品可用血液替代） 两 份 于具盖离心管中 ，一份 作 为空白样品 ， 一份添加佐匹克隆或右佐匹克隆标准物质 ， 作为添加样品（ 佐
11、匹克隆 添加样品的浓度为 20ng/mL(g)） ，右佐匹克隆 添加样品的浓度为 100ng/mL(g)） ，作为添加样品，与检材样品平行操作， 得到空白样品提取液和添加样品提取液供仪器 分析 。 7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 仪器 条件 7.1.2.1.1 佐匹克隆液相色谱 -质谱 条件 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整： a) 色谱柱： ZORBAX Eclipse Plus C18 色谱柱（ 2.1mm100mm， 1.8m）或 其他 等效柱； 注： ZORBAX Eclipse Plus C18 柱为 Agilent 公司产品的商品名称，给出这一信
12、息是为了方便本标准的使用者，并不 是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 流动相及梯度洗脱条件见表 1； 表 1 流动相和梯度洗脱条件 c) 进样量： 1.0L 10.0L； d) 扫描方式：正离子扫描 （ ESI+） ； e) 检测方式：多反应监测 （ MRM） ； 时间 min 流速 mL/min 流动相 A （含 0.1%甲酸 的 5mmol/L 乙酸铵溶液） 流动相 B （乙腈） 0.1 0.4 90% 10% 1.0 0.4 40% 60% 2.0 0.4 40% 60% 2.1 0.4 90% 10% 4.0 0.4 90% 10% GA
13、/T 4 f) 电喷雾电压： 5500V； g) 离子源温度： 650； h) 雾化气压力： 55psi； i) 气帘气压力： 30psi； j) 辅助气压力： 50psi； k) 佐匹克隆的 MS 参考条件 （ 定量离子对 、去簇电压、碰撞能 ） 见 表 2。 表 2 佐匹克隆的 MS参考条件 名称 保留时间 min 定量离子对 定性离子对 去簇电压 V 碰撞能量 eV 佐匹克隆 1.26 389.0 244.9 389.0 244.9 70 22 389.0 345.0 70 12 7.1.2.1.2 右佐匹克隆液相色谱 -质谱 条件 以下为参考条件，可根据不同 仪器和不同样品等实际情况进
14、行调整： a) 色谱柱： Lux 3u Cellulose-1手性色谱 柱（ 150mm2.0mm， 3m） 或 其他 等效柱； 注： Lux 3u Cellulose-1色谱柱为 Phenomenex公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并 不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 流动相：含 0.1%二乙胺的乙腈 含 0.1%二乙胺的异丙醇 =95 5（等度洗脱） ； c) 进样量： 1.0L 10.0L； d) 流速 ： 0.4mL/min； e) 扫描方式 ：正离子 扫描 （ ESI+） ； f) 检测方式：多反应监 测（
15、 MRM） ； g) 电喷雾电压： 5500V； h) 离子源温度： 650； i) 雾化气压力： 55psi； j) 气帘气压力： 30psi； k) 辅助气压力： 50psi； l) 右佐匹克隆 的 MS 参考条 件 （ 定量离子对 、 去簇电压，碰撞能量、保留时间 ） 见表 3。 表 3 右佐匹克隆 的 MS参考条件 名称 保留时间 min 定量离子对 定性离子对 去簇电压 V 碰撞能量 eV 右佐匹克隆 1.43 389.0 244.9 389.0 244.9 70 22 389.0 345.0 70 12 7.1.2.2 进样 分别吸取检材 、 空 白和添加样品提取液 及标准工作 溶
16、液，按 7.1.2.1分析条件进样分析。 7.2 定量分析 7.2.1 样品 提 取 移取血液 等液体 检材 样品 1.0mL 2.0mL，或称取 铰 碎的肝脏等固体 检材 样品 1.0g 2.0g各两份，按 7.1.1进行操作。 GA/T 5 另取等量相似基质的空白样品三份，其中两份分别添加佐匹克隆 或 右佐匹克隆标准物质作为添加样 品（添加样品中目标物含量应为检材样品中目标物含量的 (10050)% ），另一份作为空白样品，与检材 样品平行操作，得到空白样品提取液和添加样品提取液供仪器 分析 。 7.2.2 仪器检测 7.2.2.1 仪器 条件 按 7.1.2.1 规定的分析条件 。 7.
17、2.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液及 标准工作溶液， 按 7.1.2.1 分析条件每个样品进样分析 2 3 次。若要报告测量不确定度，每个样品分析次数应 不少于 6 次。 7.2.3 计算 7.2.3.1 计算含量 记录各样品 提取液 平行进样 2 3 次 的 目标物 保留时间和 峰面积值，按公式 （ 1） 计算含量： 添样添 样添样 VMA VMAW = . (1) 式中： W 检材样品中目标物 的含量，单位为微克每克 （ g/g） 或微克每毫升 （ g/mL） ； A 样 检材 样品 提取液 中目标物的峰面积平均值； M 添 添加样品中标准物质的添加量，单位为微克 （ g
18、） ； V 样 检材 样品的定容体积，单位为毫升 （ mL） ； A 添 添加样品 提取液 中目标物的峰面积平均值； M 样 检材 样品的取样量，单位为克 （ g） 或毫升 （ mL） ； V 添 添加样品的定容体积，单位为毫升 （ mL） 。 7.2.3.2 计算相对相差 记录 两 份平行操作的 检材 样品 中目标物的 含量，按公式 （ 2） 计算相对相差 ： %100 X XXRD 21 = . (2) 式中： RD 相对相差 ， 用百分比（ %）表示 ； X1、 X2两份 检材 样品平行定量测定的含量数值； X 两份 检材 样品平行定 量测定含量的平均值。 8 结果评价 8.1 定性结果
19、评价 8.1.1 阳 性结果评价 在相同条件下进行样品测定时，检材样品中目标物的色谱峰保留时间与标准溶液一致（相对误差在 2.5%之内）、目标物的定性离子（至少两对定性离子）与标准溶液一致，且离子丰度比与浓度接近的 GA/T 6 标准溶液相比，相对偏差不超过表 4 规定的范围，空白样品无干扰，则可判断检材样品中检出目标物。 相关的液相色谱 -质谱图参见附录 A。 表 4 离子对 丰度比的最大允许偏差范围 离子丰度比 50% 20 50 10 20 10% 最大允许相对偏 差 20 25 30% 50% 8.1.2 阴性结果评价 检 材样品未出现与目标物标准溶液一致的色谱峰，且添加样品中出现与目
20、标物标准溶液一致的色谱 峰，空白样品无干扰，则可判断检材样品中未检出目标物。 方法检出限参见附录 A。 8.2 定量结果评价 如果检材 样品中目标物含量的 RD 20%，定量数据可靠 ， 其含量按两份检材 样品的平均值计算。 如果目标物含量的 RD20%，定量数据不可靠。 应 按 7.2 重新提取检验 。 佐匹克隆和右佐匹克隆的相关资料参见附录 B。 GA/T 7 附 录 A （资料 性附录） 佐匹克隆和右佐匹克隆的相关 图谱 A.1 按 7.1.2.1.1条件分析 的 液相 色谱 -质谱 提取离子流图 按 7.1.2.1.1 条件分析 佐匹克隆的液相色谱 -质谱提取离子流图见图 A.1。 图
21、 A.1 佐匹克隆 的提取离子流图（ tR=1.55min） A.2 按 7.1.2.1.2条件分析 的 液相 色谱 -质谱 提取离子流图 按 7.1.2.1.2 条件分析 右佐匹克隆 的提取离子流图见图 A.2，同时分析 左 佐匹克隆和 右佐匹克隆的液 相色谱 -质谱提取离子流图见图 A.3。 图 A.2 右佐匹克隆的 提取离子流图 (tR=1.43min) GA/T 8 图 A.3 同时分析 左 佐匹克隆 和右 佐匹克隆 的提取离子流图 （左 佐匹克隆 tR=1.31min，右 佐匹克隆 tR=1.43min） A.3 检出限 LC-MS 分析， 佐匹克隆 检出限为 10ng/ mL（ g
22、） ，右佐匹克隆 检出限为 30ng/ mL（ g） 。 GA/T 9 附 录 B （资料性附录） 佐匹克隆和右佐匹克隆的中毒 诊断 参考 资料 佐匹克隆 (zolpiclone)和右佐匹克隆 (eszolpiclone)是常见的非苯二氮卓类催眠药，除镇静、催眠外， 还具有抗惊厥、抗焦虑和肌肉松弛等作用，但由于药代动力学特牲 与催眠药所需要的起效快、作用持续 时间相适应，临床主要用于催眠。佐匹克隆为消旋体结构，包含左旋和右旋佐匹克隆（右佐匹克隆）， 分子式 C17H17ClN6O3，结构式见图 B.1。 佐匹克隆是外消旋的混合物，包括左旋佐匹克隆和右旋佐匹克隆 两种异构体。这两种异构体的分子式、理化性质相同，而结构呈镜像关系。因此采用常规的液质和气质 方法无法区别左旋、右旋及混合的佐匹克隆。 佐匹克隆和右佐匹克隆口服吸收迅速，对血浆蛋白具有低亲和力和低结合率，能快速广泛地分布于 各组织中（包括脑组织）。右佐匹克隆药效是佐匹克隆的两倍，但毒性比佐 匹克隆的一半还要小。据有 关资料报道，右佐匹克隆的大鼠口服 LD50为 1500mg/kg，左旋体为 300mg/kg，而消旋体为 850mg/kg。 O N N N N N O C L O N C H 3 图 B.1 佐匹克隆和右佐匹克隆结构式 _
