1、 ICS 13.310 A 92 中 华 人 民 共 和 国 公 共 安 全 行 业 标 准 GA GA/T 法庭科学 生物 检材 中甲氰菊酯等 五种 拟 除虫菊酯类农药及其代谢物 检验 液相色谱 -质谱 法 Forensic sciences Examination methods for five pyrethroid pesticides including fenpropathrin and their metabolites in biological samples LC-MS - -发布 - -实施 中华人民共和国公安部 发布 GA/T I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-
2、2009 给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技术委员会（ SAC/TC 179/SC1）提出并归口。 本标准 起草单位：重庆市公安局物证鉴定中心 、公安部物证鉴定中心。 本标准主要起草人：王俊伟、 石银涛 、 任飞 、 王绘军 、郑经 、于忠山、何毅。 GA/T 1 法庭科学 生物 检材 中甲 氰菊酯等五 种拟除虫菊酯类农药及其代谢 物 检验 液相色谱 -质谱 法 1 范围 本标准规定了法庭科学生物检材 （ 血 、尿 、肝、肾 、胃及胃内容 等） 中甲氰菊酯、氯氰菊酯、溴 氰菊酯、
3、氰戊菊酯 和 氯菊酯 及其共有代谢物 3-苯氧基苯甲酸 （ 3-PBA）的 液相色谱 -质谱（ LC-MS） 定性 定量 检验方法 。 本标准适用于 法庭科学 生物 检材 中 甲氰菊酯、氯氰菊酯、 溴氰菊酯 、氰戊菊酯 、 氯菊酯 和 3-PBA 的定性分析 及 定量分析 。 其他 可疑样品中 甲氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯 、 氯菊酯 和 3-PBA 的定性 分析和 定量分析可参照 使用 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅 注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6
4、682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 毒物分析名词术语 中界定的术语和定义适用于本文件 。 4 原理 以空白 样品 和添加 样品 作对照，按平行操作的要求， 对 生物 检材 进行 提取、净化 及 浓缩 ，采 用 液相 色谱 -质谱法定性定量 ，以保留时间 、 质谱特征离子 和 相对丰 度 比 作为定性判断依据 ； 以峰面积为依据， 采用 内标 法 进行定量分析 。 5 试 剂 和 仪器 5.1 试剂 实验 用水应符合 GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法 中规定的一级水。除非另有说明，在分 析中使用的试剂均为分析纯
5、，试剂包括 ： a) 甲醇 （色谱纯） ； b) 乙腈 （色谱纯） ； c) 5mmol/L 乙酸铵溶液：称取乙酸铵 0.385g， 加水 定容至 1000mL，混匀 ； d) 0.1mol/L 盐酸溶液 ： 量 取浓盐酸 9mL， 加水定容至 1000mL， 混匀 ； e) 乙酸乙酯 ； f) 无水乙醇 ； g) 标 准溶液： GA/T 2 1） 1.0mg/mL标准 物质溶液 ： 根据 甲 氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氯菊酯和 3-PBA 标准物质的纯度， 各称取适量， 分别用甲醇配制 1.0mg/mL氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、 氰戊菊酯、氯菊酯和 3-PBA标准物质溶液 ，置
6、 于 冰箱中 冷藏 保存 。 有效期 6个月 。或采用 市售标准溶液 ； 2） 10.0g/mL混合 标准工作 溶液 ： 移 取 1.0mg/mL甲氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、 氯菊酯和 3-PBA标准物质溶液各 0.1mL，用甲醇定容至 10mL，混匀，密封，置于冰箱中 冷藏保存 。 有效期 1个月。实验中所用其他浓度的混合标准工作溶液 均由 10.0g/mL混合 标准溶液用甲醇稀释得到 ； 3） 1.0mg/mL内标 溶液 ： 根据 反式氯氰菊酯 -D6的纯度，称取适量，分别用甲醇配制 1.0mg/mL 内标 溶液 ， 置 于 冰箱中 冷藏 保存。有效期 12个月 。或采用市售标
7、准溶液； 4） 1.0g/mL内标工作液 取 ： 移取 1.0mg/mL内标 溶液 0.1mL，用甲醇 稀释并定容值 10mL， 配 制成 浓度为 10.0g/mL内标工作溶液 ，置冰箱中冷 藏 保存 有效期 6个月。 实验中所用其他 浓度的 内标 工作溶液均由 1.0mg/mL内标 溶液用甲醇稀释得到 。 注： 特殊情况下可使用对照溶 液代替标准溶液。 5.2 材料 材料包括 ： a) 具盖离心管 ； b) 具塞玻璃试管； c) 有机 系微孔滤膜 ： 0.22m。 6 仪器与 设备 仪器与 设备包括 ： a) 液相色谱 -质谱仪 ： 配有电喷雾（ ESI）离子源 和 三重四极杆质量分析器；
8、b) 电子 天平 ； c) 离心机 ； d) 振荡 器 ； e) 移液器 ； f) 浓缩 器 ； g) 超声波 清洗 器 。 7 操作方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品提取 7.1.1.1 液液萃取 移 取 血液等 液体 检材 样品 1.0 mL， 或 称取 铰碎 （或匀浆） 的 肝脏等 固体 检材 样品 1.0g 于具 盖离心 管 中 ，添加 100ng 反式氯氰菊酯 -D6， 用 0.1mol/L 盐酸调节 pH 值 至 4， 加入 二氯甲烷 5mL， 振荡 5min， 超声提取 10min， 高速 离心 5min， 分离有机相；重复提取一次，合并两次提取的有机相 ， 置于浓缩器 上
9、 常温空气流下 浓缩至干， 残留物 用 甲醇 /水（ 体积比 4:1） 200L 溶解 ， 用 0.22m 有机 系微孔 滤膜 过 滤 ， 作为检材样品提取液 供 仪器 分析。 注： 检材样品取样量和二氯甲烷体积可根据实际情况调整。 GA/T 3 7.1.1.2 质控样品制备 取 等量相似基质的空白样品 （若无相似基质空白样品可用血液替代）两份于具盖离心管中，一份作 为空白样品，一份添加 甲氰菊酯 、 氯氰菊酯、溴氰 菊酯、氰戊菊酯 、 氯菊酯和 3-PBA 标准物质 ， 作为 添加样品 （ 添加样品浓度为 5ng/mL(g)）， 与检材样品平行操作 ，得到 空白样品提取液和添加样品提取 液供
10、仪器分析 。 7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 仪器条件 7.1.2.1.1 液 相色谱 -质谱条件 （ 适用于 甲氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氯菊酯液和 反式 氯氰菊酯 -D6检验 ） 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同 样品 等 实际情况进行调整： a) 色谱柱： Zorbax RRHD Elipse Plus18 柱（ 2.1mm100mm， 1.8m） 或等效色谱 柱 ； 注： Zorbax RRHD Elipse Plus18 柱 是 Agilent 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并 不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效
11、果，则可使用这些等效产品。 b) 进样量： 1L ； c) 流速： 0.5mL/min； d) 流动相： A： 甲醇 ； B： 5mmol/L乙酸铵 水溶液 ， 梯度洗脱程序见表 1； 表 1 五 种拟除虫菊酯类农药及 反式氯氰菊酯 -D6 的 梯度洗脱 条件 时间 min 5mmol/L 乙酸铵 水 溶液 甲醇 0.1 20% 80% 1.0 20% 80% 2.0 80% 20% 5.0 80% 20% 5.1 20% 80% 8.0 20% 80% e) 离子源：电喷雾离子源（ ESI）； f) 扫描方式：正离子扫描； g) 检测方式：多反应监测 （ MRM）； h) 电喷雾电压： 55
12、00V； i) 离子源温度： 600； j) 雾化气压力： 50 psi； k) 辅助加热气压力： 50 psi； l) 气帘气压力： 30 psi； m) MS 参考条件 （离子对、碰撞电压、去簇电压、入口电压、出口电压等） ： 见表 2。 GA/T 4 表 2 五 种拟除虫菊酯类农药及 反式氯氰菊酯 -D6 的 MS 参考条件 化合物 定性 离子对 碰撞电压 V 去簇电压 V 入口电压 V 出口电压 V 甲氰菊酯 350.3125.2* 16 70 13 13 350.397.2 44 氯氰菊酯 433.1191.1* 20 35 8.6 17 433.1127 45 溴氰菊酯 523.1
13、281* 7 70 7 25 523.1199.2 17 氰戊菊酯 437.2167.1* 21 52 8 19 437.2125 56 氯菊酯 408.3221.1* 15 70 10 20 408.3250.1 15 反式氯氰菊酯 -D6 439.3197.1 23 51 23 10 注： *表示定量离子对。 7.1.2.1.2 液相色谱 -质谱条件 （ 适用于 3-PBA 检验 ） 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同 样品 等 实际情况进行调整： a) 色谱柱： Zorbax RRHD Elipse Plus C18 柱（ 2.1mm100mm， 1.8m），或等效色谱柱 ； 注：
14、 Zorbax RRHD Elipse Plus C18 柱 是 Agilent 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者， 并 不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 进样量： 1L； c) 流速： 0.5mL/min； d) 流动相： A： 乙腈 ； B： 水， 梯度洗脱程序见表 3； 表 3 3-PBA 液相色谱的 梯度洗脱 条件 时间 min 流速 mL/min 水 乙腈 0.1 0.5 90% 10% 2.0 0.5 90% 10% 2.1 0.5 2% 98% 4.0 0.5 2% 98% 4.1 0.5 90% 10%
15、 7.0 0.5 90% 10% e) 离子源：电喷雾离子源（ ESI）； f) 扫描方式：负离 子扫描； g) 检测方式：多反应 离子 监测 （ MRM）； h) 电喷雾电压 ： -4500V； i) 离子源温度 ： 650； j) 雾化气压力 ： 60 psi； GA/T 5 k) 辅助加热气压力： 50 psi； l) 气帘气压力 ： 20 psi； m) 3-PBA 的 MS 参考条件 （离子对、碰撞电压、去簇电压、入口电压、出口电压等） 见 表 4。 表 4 3-PBA 的 MS 参考条件 化合物 母离子 子离子 碰撞电压 eV 去簇电压 V 入口电压 V 出口电压 V 3-PBA
16、213.1 92.9 -26.2 -70 -9 -8 169 -16 7.1.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液及标准工作溶液，按 7.1.2.1的分析条件进样分析。 7.2 定量分析 7.2.1 样品 提取 移取血液等液体检材样品 1.0mL，或称取铰碎的肝脏等固体检材样品 1.0g两份，按 7.1.1进行操作。 内标 -工作曲线法：另取等量相似基质的空白样品六份，一份作为空白样品，另外五份添加不同浓 度的标准物质（添加浓度应呈良好的线性关系，且检材样品中目标物的含量应在线性范围内），作为添 加样品，与检材样品平行操作。 内标 -单点校正法：另取等量相似基质的空白样品两份，一份
17、作为空白样品，另外 一份添加标准物 质（检材样品中目标物含量应为添加样品中目标物含量的 (10050)%，作为添加样品，与检材样品平行 操作。 7.2.2 仪器 检测 7.2.2.1 仪器条件 按 7.1.2.1规定的条件分析 。 7.2.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液及标准工作溶液，按 7.1.2.1的分析条件每个样品进样分析 2 3次。若要报告测量不确定度，每个样品分析次数应不少于 6次。 7.2.3 计算 7.2.3.1 计算含量 7.2.3.1.1 内标 -标曲法 在系列浓度的添加样品中，以目标物与内标 物 定量离子对的峰面积比（ Y）为纵坐标、目标物浓度 （ W）为
18、横坐标进行线性回归，得线性方程。 根据检材样品中目标物与内标定量离子对峰面积比，按公式（ 1）计算出待测样品中目标物的质量 浓度。 . (1) 式中： GA/T 6 W 检材样品中目标物的含量，单位为微克每克（ g/g）或微克每毫升（ g/mL）； Y 检材样品提取液中目标物与内标峰面积比； a 线性方程的截距； b 线性方程的斜率。 7.2.3.1.2 内标 -单点法 记录检材样品提取液和添加样品提取液中目标物和内标的保留时间和峰面积值，按公式 (2)计算校 正因子，按公式 (3)计算含量： 标内 内标 AM AMf = . (2) 式中： f 校正因子； M 标 添加样品中目标物添加量，单
19、位为微克 (g)； A 内 添加样品中内标物峰面积平均值； M 内 添加样品中内标物添加量，单位为微克 (g)； A 标 添加样品中目标物峰面积平均值。 样内 内样 MA MAfW = . (3) 式中： W 检材样品中目标物的含量，单位为微克每克（ g/g）或微克每毫升（ g/mL）； f 校正因子； A 样 检材样品提取液中目标物峰面积平均值； M 内 检材样品中 内标物添加量，单位为微克 (g)； A 内 检材样品提取液中内标物峰面积平均值； M 样 检材样品的取样量，单位为毫升 (mL)。 7.2.3.2 计算 相对相差 记录两份平行操作的检材 样品中目标物的 含量，按公式（ 4）计算
20、相对相差 ： %10021 = X XXRD .(4) 式中： RD 相对相差 ，用百分比（ %）表示 ； X1、 X2 两个检材样品平行定量测定的含量数值； X 两个检材样品平行定量测定含量的平均值。 8 结果评价 8.1 定性结果评价 8.1.1 阳 性 结果 评价 在相同条件下进行样品测定时，检材样品中目标物的色谱峰保留时间与标准溶液一致（相对误差在 2.5%之内）、目标物的 定性离子与标准溶液一致，且离子丰度比与浓度接近的标准溶液相比，相对偏 差不超过表 5规定的范围，空白样品无干扰，则可判断检材样品中检出目标物。 GA/T 7 表 5 离子丰度比的最大允许相对偏差范围 离子丰度比 5
21、0% 20 50 10 20 10% 最大允许相对偏差 20 25 30% 50% 8.1.2 阴 性 结果 评价 检材样品未出现与目标物标准溶液一致的色谱峰，且添加样品中出现与目标物标准溶液一致的色谱 峰，空白样品无干扰，则可判断检材样品中未检出目标物。 方法检出限参见附录 A。 8.2 定 量结果评价 如果目标物含量的 RD 20%，定量数据可靠，其含量按 两 份检材的平均值计算。 如果检材样品中 目标物含量的 RD20%，定量数据不可靠。应按 7.2重新提取检验。 拟除虫菊酯类农药 的检出限及 在生物体内的代谢 参见附录 A， 鱼塘投毒案中检材选择、保存和 样品 提取 参见附录 B。 G
22、A/T 8 附 录 A （资料性附录） 拟除虫菊酯类农药 的检出限及 在生物体内的代谢 A.1 方法 检出限 采用 LC-MS 分析，方法检出限均为 10ng/mL(g)，定量下限均为 50ng/mL(g)。 A.2 拟除虫菊酯类的体内代谢 拟除虫菊酯类农药在生物体内的代 谢，主要是化合物酯键处断裂。在体内代谢为菊酯类农药的非特 异代谢产物 3-苯氧基苯甲酸（ 3-PBA）和特征代谢产物。以甲氰菊酯为例，其在体内代谢为 3-PBA 和 四甲基环丙烷羧酸（甲氰菊酸）的葡萄糖醛酸。在自然界中，主要分解为 3-PBA 和甲氰菊酸。见图 A.1 甲氰菊酸 甲氰菊酯 3-PBA 图 A.1 甲氰菊酯结构
23、及代谢示意图 O H O C H 3 H 3 C H 3 C C H 3 O O O H GA/T 9 附 录 B （资料性附录） 鱼塘投毒案中检材选择、保存和 样品提取 拟除虫菊酯农药（ pyrethroid pesticides）是一种在 农业生产中广泛应用的杀虫剂，因其对鱼类、昆 虫具有极强毒性，不法分子常使用该类农药对鱼塘投毒。 鱼塘投毒案中检材的选择、保存注意事项和样品提取过程包括： a) 鱼中毒死亡时，鱼内脏和鱼鳃中拟除虫菊酯农药含量最高，结合鱼塘水可以大体积萃取富集的 特点，所以在死亡早期，鱼内脏、鱼鳃和鱼塘水是最佳提取检材 ； b) 拟除虫菊酯农药在鱼体和鱼塘水中降解较快，尤其
24、是在鱼塘水和鱼内脏中。所以在鱼塘投毒案 中，应尽早提取检材。以甲氰菊酯为例，鱼塘水在鱼中毒死亡 5d后，甲氰菊酯含量下降 62.1%， 此后对鱼塘水进行检测意义不大。拟除虫菊酯农药在 鱼鳃中的含量较高且相对稳定，受外界 干扰影响较小。以甲氰菊酯为例，鱼中毒死亡 5d7d天后，甲氰菊酯在鱼内脏中的含量已低于 鱼鳃。若受客观原因制约，检材提取或检验不及时， 3-PBA应做为主要甚至是唯一的检测目标， 3-PBA的检测能够为鱼塘投毒案定性的提供间接证据。 3-PBA性质稳定，不易分解，在提取回 收率和仪器检测灵敏度方面均高于甲氰菊酯 ； c) 保存检材时毒物的分解动力学主要受保存条件的影响，包括温度
25、、时间、器皿类型、防腐剂、 pH值等。其中，温度是影响保存生物检材中毒物分解主要因素之一。温度在 2035时，生 物 检材的腐败发生最快，因而毒物及其代谢产物的分解速度也较快。所以，采取的检材要低 温或加入抑菌剂保存，以防止细菌分解药物，提高药物原体残留度 ； d) 取鱼塘水检材 100 mL（或大于 100 mL）于三角烧瓶中，添加 100ng的内标物反式氯氰菊酯 -D6。 用 0.1mol/L盐酸调 pH值至 4，然后加入二氯甲烷 15mL，振荡后超声提取 10min，取有机相于 50mL 离心管中（提取两次，将提取液合并），常温空气流下挥干后残留物里加入甲醇 /水（体积比 4： 1） 200L溶解，用 0.22m有机滤膜过滤，作为检材样品提取液供仪器分析。
