1、 ICS 13.310 A 92 中 华 人 民 共 和 国 公 共 安 全 行 业 标 准 GA GA/T 法庭科学 生物检材中河豚毒素检验 液相色谱 -质谱法 Forensic sciences Examination methods for tetrodotoxin in biological samples LC-MS - -发布 - -实施 中华人民共和国公安部 发布 GA/T I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技术委员会
2、（ SAC/TC 179/SC 1）提出并归口。 本标准起草单位：司法鉴定科学研究 院、公安部物证鉴定中心 。 本标准主要起草人：刘伟、沈敏、卓先义、沈保华、向平 、严慧、于忠山、王芳琳 。 GA/T 1 法庭科学 生物检材中河豚毒素检验 液相色谱 -质谱法 1 范围 本标准规定了 法庭科学 生物检材 （ 血、尿、肝、肾、胃及 胃内容等 ） 中河豚毒素的液相色谱 -质谱 （ LC-MS）定性定量检验方法。 本标准适用于法庭科学生物检材中河豚毒素的定性、定量分析。 其他可疑 样 品 中 河豚毒素 的定性 、 定量分析可参照使用 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注
3、日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本文件。 4 原理 以空白样 品和添加样品作对照，按平行操作的要求，对生物检材进行提取、净化及浓缩，采用液相 色谱 -质谱法定性定量，以保留时间、质谱特征碎片离子峰和相对丰度比作为定性判断依据；以峰面积 为依据，采用外标法进行定量分析 。 5 试剂 及 材料 5.1 试剂 试验用水应符合 GB/T 6682 中规定的一级水。试剂包括： a)
4、 甲醇：色谱纯 ； b) 冰乙酸：分析纯 ； c) 浓盐酸：优级纯 ； d) 乙腈：色谱纯 ； e) 甲酸：优级纯； f) 0.1%甲酸溶液：移取 0.1mL 甲酸于 100mL 容量瓶中，用水定容 至 100mL； g) 1%乙酸甲醇溶液：移取 1mL 冰乙酸于 100mL 容量瓶中，用甲醇 定容 至 100mL； h) 1%乙酸溶液：移取 1mL 冰乙酸于 100mL 容量瓶中，用水定容 至 100mL； i) 流动相：乙腈 :0.1%甲酸 水 溶液（体积比 90:10） ； GA/T 2 j) 标准溶液： 1) 1.0mg/mL 标准物质溶液 ：根据河豚毒素标准物质的纯度，称取适量 ，
5、用甲醇配制 1mg/mL 河豚毒素标准物质溶液，置于冰箱中冷藏保存。 有效期 6 个月。 或 采用 市售标准溶液 ； 2) 10.0g/mL 河豚毒素 标准工作 溶 液 ： 移取 1.0mg/mL 的 河豚毒素 标准物质溶液 0.1mL 于 10mL 容量瓶中 ， 用甲醇 定容 至 10mL，混匀 ， 密封，置 于 冰箱中冷 藏 保存 。 有效期 3 个 月 。 实 验中所用其 他 浓度的标准工作溶液 均由 1.0mg/mL 标准物质 溶 液用甲醇稀释得到 。 注 ： 特殊情况下可使用对照溶液代替标准溶液 。 5.2 材料 材料 包括： a) 固相萃取柱 ： Oasis MCX 固相萃取柱或
6、等效固相萃取柱 ，使用前依次 用甲醇 、 水活化 ； 注： Oasis MCX 柱是 Waters 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产 品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 一次性注射器 ； c) 有机系微孔滤膜： 0.22m； d) 具盖离心管 ； e) 具塞玻璃试管 。 6 仪器和设备 仪器和设备包 括： a) 液相色谱 -质谱仪： 配电喷雾离子源 （ ESI）和三重四极杆质量分析器； b) 固相萃取仪； c) 电子 天平； d) 鼓风恒温干燥箱； e) 浓缩器； f) 振荡器 ； g) 离心机 ； h) 移液器 。
7、 7 操作方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品提取 7.1.1.1 检材样品提取 7.1.1.1.1 血液、尿液固相萃取 移取血液等液 体检材样品 1.0mL 于具盖离心管中 ， 加入 1%乙酸甲醇溶液 1.5mL， 振荡 ， 13000r/min 离心 3min，取上清液转移至已活化好的固相萃取柱 中 ， 控制上清液过柱流速为 0.5mL/min， 依次用 1mL 乙腈、 1mL 甲醇、 1mL 水 淋洗，挤干水分或离心或真空抽固相萃取柱 2min，用 0.2mol/L 盐酸溶液 /甲 醇（体积比为 4： 1） 1mL 洗脱，洗脱液置于浓缩器上 60C 浓缩至干， 残留物 用流动相 20
8、0L 溶解 ， 用有机系微孔滤膜过滤， 作为检材样品提取液， 供 仪器分析 。 GA/T 3 7.1.1.1.2 组织固相萃取 称取铰碎组织 0.5g 于具盖离心管中 ， 用 1%乙酸甲醇溶液 1.5mL 浸泡 2h 后， 振荡 ， 13000r/min 离 心 3min，取上清液转移至已活化好的固相萃取柱上， 其余按照 7.1.1.1.1 操作。 7.1.1.1.3 血液、尿液 液液萃取 移取血液等液体 检材样品 1.0mL 于具盖离心管中，加入 1%乙酸甲醇溶液 1.5mL，混匀后 3500r/min 离心 10min，取上清液， 剩余检材 再加入 1%乙酸甲醇溶液 1.5mL，再次提取，
9、合并上清液。将上清液 在 60浓缩器中用空气流吹干， 残留物 用 1%乙酸溶液 0.25mL 复溶，再加入 0.25mL 氯仿，震荡后 13000r/min 离心 3min，取上清液供仪器分析。 7.1.1.1.4 组织液液萃取 称取铰碎组织 0.5g 于具盖离心管中 ， 用 1%乙酸甲醇溶液 1.5mL 浸泡 2h 后， 振荡 ， 13000r/min 离 心 3min，取上清液 ，剩余检材 再加入 1%乙酸甲醇溶液 1.5mL， 其余按照 7.1.1.1.3 操作。 7.1.1.2 质控样品制备 取等量相似基质的空白样品（若无相似基质空白样品可用血液替代）两份于具盖离心管中，一份作 为空白
10、样品，一份添加河豚毒素标准物质，使其 含量 为 10ng/mL(g)，作为添加样品 ，与检材样品平行操 作，得到空白样品提取液和添加样品提取液 ， 供仪器 分析 。 7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 仪器 条件 （液相色谱 -质谱条件） 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况 进行调整： a) 色谱柱： PC HILIC 柱（ 100mm2.0mm， 5m）或 等效色谱柱； 注： PC HILIC 是资生堂公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的 认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 流动相： A：乙腈 ，
11、 B： 0.1%甲酸溶液； c) 洗脱方式：梯度洗脱，梯度见表 1； 表 1 梯度洗脱程序 时间 min A B 0 90% 10% 0.8 90% 10% 1.2 20% 80% 2.5 20% 80% 4.0 90% 10% 10 90% 10% d) 流速： 0.2mL/min； e) 柱温：室温 ； f) 进样量： 5L； g) 离子 源 ：电喷雾离子源（ ESI） ； h) 扫描方式：正离子； GA/T 4 i) 检测方式 ：多反应离子监测（ MRM）； j) 离子源电压 （ IS） ： 5500V； k) 碰撞气 （ CAD） 、气帘气 （ CUR） 、雾化气 （ GS1)、辅助气
12、 （ GS2） 均为高纯氮气； l) 河豚毒素的 LC-MS 参数 见表 2。 表 2 河豚毒素的 LC-MS 参数 名 称 定性离子对 定量离子对 去簇电压 V 碰撞电压 eV 保留时间 min 河豚毒素 320.1302.1 320.1302.1 90 35 6.74 320.1284.1 40 7.1.2.2 进样 分别吸取检材、空白和 添加样品提取液，按 7.1.2.1 的条件进样分析。空白血液、添加河豚毒素色 谱图参见附录 A 中图 A.1、图 A.2。 7.2 定量分析 7.2.1 样品提取 移取血液等液体检材样品 1.0mL，或称取铰碎的肝脏等固体检材样品 1.0g两份，按 7.
13、1.1进行操作。 另取等量相似基质的空白样品三份，其中两份添加河豚毒素标准物质作为添加样品（添加样品中目 标物含量应为检材样品中目标物含量的 (10050)%），另一份作为空白样品，与检材样品平行操作，得 到空白样品提取液和添加样品提取液供仪器检测。 7.2.2 仪器检测 7.2.2.1 仪器条件 按 7.1.2.1 规定的 条件分析。 7.2.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液，按 7.1.2.1 的 分析条件每个样品进样分析 2 3 次。若要报 告测量不确定度，每个样品分析 份 数应不少于 6 次。 7.2.3 计算 7.2.3.1 计算含量 7.2.3.1.1 外标 -单点
14、校正 法 记录各样品提取液中平行进样 2 3 次目标物的保留时间和峰面积值，按公式（ 1）计算含量： 添样添 样添样 VMA VMAW = . (1) 式中： W检材样品中目标物的含量，单位为微克每克（ ng/g）或微克每毫升（ ng/mL）； A样 检材样品提取液中目标物峰面积平均值； GA/T 5 M添 添加样品中 目标物 添加量，单位为微克（ g）； V样 检材样品的定容体积，单位为毫升（ mL）； A添 添加样品提取液中目标物峰面积平均值； M样 检材样品的取样量，单位为克（ g）或毫升（ mL）； V添 添加样品的定容体积，单位为毫升（ mL）。 7.2.3.1.2 外标 -标准曲线
15、 法 在系列浓度河豚毒素添加样品中，以河豚毒素定量离子对的峰面积（ Y）为纵坐标、河豚毒素 含量 （ W）为横坐标进行线性回归，得线性方程。 根据 检材 样品中河豚毒 素的峰面积值，按公式 (2)计 算河豚毒素含量： (2) 式中： W 检材样品中河豚毒素的含量，单位为纳克每克（ ng/g）或纳克每毫升（ ng/mL）； Y 检材样品中河豚毒素峰面积平均值 ； a 线性方程的截距； b 线性方程的斜率。 7.2.3.2 计算相对相差 记录两份平行操作的检材样品中目标物的含量，按 公式（ 3）计算相对相 差： (3) 式中： RD 相对相差， 用百分比（ %）表 示 ； X1、 X2两个检材样品
16、平行定量测定的含量数值； X 两个检材样品平行定量测定含量的平均值。 8 结果评价 8.1 定性结果评价 8.1.1 阳性结果评价 在相同条件下进行样品测定时，检材样品中 河豚毒素 的色谱峰保留时间与 添加样品中的 一致（相对 误差在 2.5%之内）、 河豚毒素 的定性离子 对 与 添加样品的 一致，且离子 对 丰度比与 含量 接近的 添加样 品 相比，相对 误 差不超过表 3 规定的范围，空白样品无干扰，则可判断检材样品中检出 河豚毒素 。 表 3 离子丰度比的最大允许 相对误 差 范围 GA/T 6 离子丰度比 50% 20 50 10 20 10% 最大允许相对 误差 20 25 30%
17、 50% 8.1.2 阴性结果评价 检材样品未出现与 添加样品中河豚毒素 一致的色谱峰，且空白样品无干扰，则可判断检材样品中未 检出 河豚毒素 。 8.2 定量结果评价 如果目标物含量的 RD 20%，定量数据可靠，其含量按两份检材的平均值计算。如果检材样品中 目标物含量的 RD 20%，定量数据不可靠。应按 7.2重新提取检验 。 8.3 相关资料 方法学有效性验证参见附录 B，河豚毒素的中毒诊 断参考资料参见附录 C。 GA/T 7 A A 附录 A （资料性附录） 河豚毒素的相关谱图 空白血液、添加血液的色谱图见图 A.1、图 A.2。 图 A.1 空白血液的 MRM 色谱图 图 A.2
18、 空白血液中添加 10ng/mL 河豚毒素的的 MRM 色谱图 GA/T 8 B 河豚毒素的 B 附录 B （资料性附录） 方法学有效性验证 B.1 工作曲线、线性范围及检出限 数据采用： 河豚毒素 采用 320.1/302.1 离子 对峰面积 。 工作曲线方程、线性范围及检出限（ LOD）见表 B.1。 表 B.1 工作曲线方程、线性范围及检出限 样品 目标物 回归方程 线性范围 ng/mL（ g） r2 LOD ng/mL（ g） 血液 河豚毒素 y =502x + 406 5-100 0.9984 2 尿液 河豚毒素 y =148x - 339 5-100 0.9993 2 肝组织 河豚
19、毒素 y =382x + 2660 5-100 0.9973 4 B.2 精密度和回收率 精 密度和回收率见表 B.2。 表 B.2 测定血液、尿液、肝组织中河豚毒素含量的精密度和回收率 样品 添加 河豚毒素 含量 ng/mL（ g） 精密度（ RSD） 回收率 日内精密度 （ n=6） 日间精密度（ n=4） 血液 8 7.12% 10.77% 57.9% 40 4.76% 7.16% 56.8% 80 3.59% 5.32% 57.6% 尿液 8 8.13% 12.78% 68.3% 40 5.33% 7.90% 76.6% 80 5.05% 7.27% 87.1% 肝 组织 8 8.55
20、% 12.80% 49.6% 40 4.20% 7.53% 54.4% 80 6.70% 5.75% 53.3% GA/T 9 附 录 C （资料性附 录） 河豚毒素中毒诊断参考资料 C.1 理化性质 河豚毒素 （ tetrodotoxin，简称 TTX）系 河豚 体内所含剧毒成分。 TTX 分子式为 C11H17N3O8，分子量为 319.27。 TTX 粗制品为棕黄色粉末，纯品为白色结晶性粉末， 无臭、无味、易吸湿潮解，微溶于水、乙醇溶液，极易溶于稀酸水溶液，不溶于无水乙醇、乙醚、氯仿、 苯等有机溶剂。在中性和酸性条件下对热稳定，如遇碱和强酸时易脱水、分解。 C.2 中毒机理 河豚毒素进入
21、体内产生类似箭毒样作用，是细胞膜钠离子通道选择性阻断剂，可致细胞膜去极化， 从而特异性 地干扰神经 -肌肉的传导过程，主要表现为神经中枢和神经末梢的麻痹。一般先是感觉神经 麻痹，继而运动神经麻痹，使肢体无力甚至不能运动。血管中枢麻痹引起血压下降，脉搏迟缓。呼吸中 枢麻痹导致呼吸停止而死亡。 C.3 中毒症状 中毒的原因多以误食或食 用加工、烹调不得法的河豚鱼所致。 河豚毒素 中毒的症状主要为：舌尖 及嘴唇发麻，进一步经上肢到足尖以致全身麻痹，有时还会出现运动障碍、头晕头痛、恶心呕 吐、血压下降、呼吸困难，严重者因呼吸衰竭而死亡 。 C.4 河豚毒素致死量 河豚毒素对人的致死量为 6g/kg 7g/kg。 最小急性中毒量和最小致死量分别为 0.2mg 和 2mg。 _
