1、 ICS 13.310 A 92 中 华 人 民 共 和 国 公 共 安 全 行 业 标 准 GA GA/T 法庭科学 生物检材中灭多威和灭多威 肟 检验 气相色谱 -质谱 和 液相 色谱 -质谱法 Forensic sciences Examination methods for methomyl and methomyl oxime in biological samples GC-MS and LC-MS - -发布 - -实施 中华人民共和国公安部 发布 GA/T I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009 给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布
2、机构不承担识别这些专利的责任 。 本标准由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析 分技术委员会（ SAC/TC 179/SC 1） 提出并 归口。 本标准起草单位：公安部物证鉴定中心 、 运城市公安局 。 本标准主要起草人： 王瑞花 、 张云峰 、 常靖 、 任昕昕 、 王爱华 、 刘彦军 。 GA/T 1 法庭科学 生物检材中灭多威和 灭多威肟 检验 气相色谱 -质谱和液相色谱 -质谱 法 1 范围 本标准规定了生物检材 （血、尿、肝、肾 、胃及胃内容等） 中灭多威 及灭多威肟 的气相色谱 -质谱 （ GC-MS） 定性 检验 方法 和液相色谱 -质谱（ LC-MS） 定性定量 检验方法 。
3、本标准适用于生物检材中灭多威 和 灭多威肟 的定性分析和定量分析 。 其他可疑 样 品中灭多威 及灭多 威肟 的定性分析和定量分析可参照使用。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件 ， 仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其 最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名 词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本文件。 4 原理 以空白样品和添加样品作对照，按平行操作的要求， 对生物检材进行 提取、净化及浓缩， 采 用气相 色谱
4、-质谱法定性 ， 液相色谱 -串联 质谱法定性定量 ， 以保留时间、质谱特征离子碎片峰和相对丰度 比 作 为定性判断依据； 以峰面积为依据，采用外标法 进行定量分析。 5 试剂 和 材料 5.1 试剂 气相色谱 -质谱 实验用水应符合 GB/T 6682中规定的三级水 ， 液相色谱 -串联质谱 实验用水应符合 GB/T 6682中规定的 一 级水。除非另有说明，在分析中使用 的试剂均为分析纯，试剂包括： a) 甲醇 ； b) 乙酸乙酯 ； c) 二氯 甲 烷 ； d) 中性 氧化铝或硅镁吸附剂 ； e) 乙腈 （色谱纯） ； f) 丙酮 ； g) 甲酸（色谱纯） ； h) 无水硫酸钠 ； i)
5、 标准溶液 ： GA/T 2 1) 1.0mg/mL 标准物质溶液 ： 根据 灭多威和灭多威肟 标准物质的纯度 ， 各 称取适量， 分别 用 甲醇配制 1.0mg/mL 灭多威 和灭多威肟 标准物质溶液 ， 置于冰箱中冷藏保存。有效期 6 个 月 。 或采用市售标准溶液 ； 2) 0.1mg/mL 混合 标准 工作 溶 液：移取 1.0mg/mL 的 灭多威 和灭多威 肟 标准物质溶液各 1.0mL， 用甲醇定容至 10mL，混匀，密封，置于冰箱中冷藏保存 。 有效期 3 个 月 。 实验中所用 其 他 浓度的混合标准工作 溶 液均由 0.1mg/mL 标准物质 溶 液用甲醇稀释得到 ； 3)
6、 10.0g/mL 灭多威和灭多威肟单一标准工作 溶 液 ： 移取 1.0mg/mL 的 灭多威 和 灭多威 肟 标 准物质溶液各 0.1mL于 10mL容量瓶中，用 甲醇 稀释至刻度，混匀 ， 配制成浓度为 10.0g/mL 的 单一标准工作 溶 液 ， 密封，置 于 冰箱中冷 藏 保存 ， 有效期 1 个月 。 实验中所用 其他 浓度 的单一标准工作溶液均由 10.0g/mL 标准物质 溶 液用甲醇稀释得到 。 注 ： 特殊情况下可使用对照溶液代替标准溶液。 5.2 材料 材料 包括： a) 具盖离心 管 ； b) 具塞玻璃试管 ； c) 固相萃取柱： Oasis HLB 柱或等效固相萃取
7、柱 ， 依次用甲醇 、 水活化 ； 注： Oasis HLB 柱是 Waters 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产 品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品 。 d) 一次性注射器 ； e) 有机系微孔滤膜 ： 0.22m。 6 仪器 和设备 仪器和设备 包括： a) 气相色谱 -质谱仪 ： 配有电子轰击源（ EI） ； b) 液相色谱 -质谱仪，配有电喷雾离子源（ ESI）和三重四极杆质量分析器 ； c) 电子天平 ； d) 离心机 ； e) 振荡 器 ； f) 移液 器 ； g) 浓缩器。 7 操作 方法 7.1 定性分析 7
8、.1.1 样品 提取 7.1.1.1 液液萃取 移取血液等液体 检材 样品 1.0mL 2.0mL，或称取铰碎的 肝脏等 固体 检材 样品 1.0g 2.0g于 具盖离心 管中 ， 加入乙酸乙酯 4.0mL 8.0mL， 振荡 5min， 8000r/min离心 10min，分离有机相；重复提取一次， 合并两次提取的有机相，用无水硫酸钠脱水后，置于浓缩器上 45浓缩至干， 残留物 用 甲醇 200L溶解 ， GA/T 3 作为检材样品提取液 供 GC-MS分析 或 用 0.22m的 有机 系 微孔滤膜过滤，供 LC-MS分析。 如 需净化，按 7.1.1.4操作。 7.1.1.2 丙酮 /水
9、混合溶剂 提取 移取血液等液体 检材 样品 5.0mL 10.0mL，或称取铰碎的 固体 检材 样品 5.0g 10.0g，用丙酮 /水混 合溶剂（体积比 4:1） 50mL 100mL浸泡 3h以上（或超声 1h以上）。 8000r/min离心 10min， 分离 上清液， 置于水浴锅上 50浓缩至 2mL左右， 离心，取 上 清液 移至离心管中，再加入乙酸乙酯 6.0mL，振荡 10min， 8000r/min离心 10min，分离有机相，重复提取一次，合并两次提取的有机相，置于浓缩器上 45浓缩至 干 ， 残留物 用 甲 醇 200L溶解 ， 作为检材样品提取液 供 GC-MS分析或 用
10、 0.22m的有机系微孔滤膜过滤， 供 LC-MS分析 。 如需净化，按 7.1.1.4操作。 7.1.1.3 固相萃取 移取血液等液 体 检材 样品 1.0mL 2.0mL，或称取绞碎的肝脏等固体 检材 样品 1.0g 2.0g于具盖离心 管中 ， 用 4倍 体积水 稀释，振荡 10min， 8000r/min离心 20min，取上清液转移至已活化好的 C18固相萃取 柱中， 控制上清液过柱流速为 0.5mL/min过柱， 依次用 1mL水、 1mL甲醇 /水 (体积比 5:95)淋洗，抽干弃 去淋 洗 液，挤干水分或离心或真空抽固相萃取 柱 2min， 用 2mL乙酸乙酯或乙酸乙酯 /二氯
11、甲烷（ 体积比 1:1）洗脱， 控制流速为 0.5mL/min， 收集 洗脱液 并 置于浓缩器上 45 浓缩至干， 残留物 用 甲 醇 200L溶 解 ， 作为检材样品提取液 供 GC-MS分析 或 用 0.22m的 有机 系 微孔滤膜过滤，供 LC-MS分析。 如需净化， 按 7.1.1.4操作。 7.1.1.4 样品净化 （中性氧化铝柱净化法） 净化过程 包括 ： a) 装柱：少许脱脂棉，依次加入无水硫酸钠 1g 2g、中性氧化铝 2g 5g 或 硅镁吸附剂、无水硫 酸钠 2g 3g； b) 净化 ： 用与 提 取 液相同的溶剂 6.0mL 预淋洗 装好的柱子，弃 去预 淋液 ， 将检材样
12、品提取液 过 柱，再用与提取液相同的溶剂 6.0mL 洗脱。收集合并过柱液 及洗脱液 ，置于浓缩器上 45 浓 缩至干 ， 用 200 L 甲醇 溶解 ， 供 GC-MS 分析 或用 0.22m 的 有机 系 微孔滤膜过滤，供 LC-MS 分析。 7.1.1.5 质控 样品制备 取 等量相 似 基质的 空白样品 （若 无 相似 基质 空白 样品可用血液替代） 两 份 于具盖离心管中 ，一份 作 为空白样品 ， 一份添加灭多威 或灭多威 肟 标准 物质 ，作为添加样品（ GC-MS添加样品的浓度为 1.0g /mL(g)， LC-MS添加 样品的浓度为 20ng/mL(g)） ， 与检材 样品
13、平行操作 ，得到 空白样品提取液和 添加样品提取液供仪器检测。 7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 仪器条件 7.1.2.1.1 气相色谱 -质谱 条件 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整： a) 色谱柱： HP-5柱（ 30m0.25mm， 0.25m）或等效色谱柱； 注 ： HP-5 柱 是 Waters 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认 可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品 。 b) 色谱柱温程： 100 保持 2min，以 30 /min速率升至 280 ，保持 17.5min； GA/T
14、 4 c) 柱流速 ： 1mL/min； d) 进样口温度： 280 ； e) 传输线温度： 230 ； f) 离子源温度： 230； g) 电子轰击能量： 70eV； h) 载气：高纯 氦 ； i) 进样方式 ： 分流进样 ， 分流比： 10:1； j) 扫描方式：全扫描（ SCAN） ，质量扫描范围 40 amu450 amu； k) 灭多威和 灭多威肟 （ 灭多威分解产物 ） 的保留时间 、特征离子 见 表 1。 表 1 灭多威和灭多威肟的保留时间及定性离子 化合物 保留时间 min 定性离子 灭多威 3.57 58,88,105,162 灭多威肟 4.47 58,88,105 7.1.
15、2.1.2 液相色谱 -质谱 条件 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整： a) 色谱柱： ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1mm50mm， 1.7m)或等效柱； 注 ： ACQUITY UPLC HSS T3 是 Waters 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不 是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品 。 b) 流动相 ： A：乙腈， B： 0.1%甲酸； c) 洗脱 方式 ：梯度洗 脱，梯度见表 2； 表 2 梯度洗脱条件 时间 min 流速 mL/min A B - 0.5 10% 9
16、0% 1.5 0.5 40% 60% 2.0 0.5 40% 60% 2.2 0.5 10% 90% 3.5 0.5 10% 90% d) 柱温： 35 ； e) 离子源：电喷雾电离源 （ ESI） ； f) 检测方式：正离子； g) 扫描方式：多反应离子监测 （ MRM） ； h) 雾化气、脱溶剂气：氮气； i) 碰撞气：氩气； j) 离子源温度： 150 ； k) 雾化温度： 350 l) 毛细管电压： 3.0kV； m) MS参考条件 （ 定性、定量离子 对 和锥孔电压、碰撞能 量 ） 见表 3。 GA/T 5 表 3 MS 参考条件 名 称 定量离子 对 定性离子 对 锥孔电压 V 碰
17、撞能量 eV 灭多威 162.9 105.9 162.96 105.9 12 8 162.96 87.9 8 灭多威肟 105.9 57.9 105.9 57.9 20 10 105.9 72.8 18 7.1.2.2 进样 分别吸取 检材、空白和添加样品提取液 及 标准工作溶液，按 7.1.2.1 的 分析条件进样分析。 7.2 定量分析 7.2.1 样品 提取 移取血液等液体 检材 样品 1.0mL 5.0mL， 或称 取铰碎的 肝脏等 固体 检材 样品 1.0g 5.0g两份 ， 按 7.1.1进行操作。 另取等量 相似 基质的空白样品 三 份， 其中 两份分别添加灭多威 和 灭多威 肟
18、 标准 物质 作为添加样品 （ 添加样品中目标物含量应为检材 样品 中目标物含量的 (10050)% ） ，另一份 作为空白样品，与检材 样品 平行 操作 ， 得到 空白样品提取液和添加样品提取液供仪器检测。 7.2.2 仪器检测 7.2.2.1 仪器条件 按 7.1.2.1.2 规定的 条件分析。 7.2.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液 及 标准工作溶液 ，按 7.1.2.1.2 的 分析条件每个样 品进样分析 2 3 次。若要报告测量不确定度，每个样品分析次数应 不少于 6 次。 7.2.3 计算 7.2.3.1 计算 含量 记录各样品 提取液 平行进样 2 3 次 的
19、目标物 保留时间和 峰面积值，按公式 （ 1） 计算含量： 添样添 样添样 VMA VMAW = . (1) 式中： W 检材样品 中目标物的含量，单位为微克每克 （ g/g） 或微克每毫升（ g/mL） ； A 样 检材 样品 提取液 中目标物峰面积平均值； M 添 添加样品中 目标物 添加量，单位为微克 （ g ） ； V 样 检材 样品 的定容体积，单位为毫升 （ mL） ； A 添 添加样品 提取液 中目标物峰面积平均值； M 样 检材 样品 的取样量，单位为克 （ g） 或毫升 （ mL） ； V 添 添加样品的定容体积，单位为毫升 （ mL） 。 7.2.3.2 计算相对相差 GA
20、/T 6 记录 2 份平行操作的 检材 样品 中目标物的 含量，按公式（ 2）计算相对相差： %10021 = X XXRD . (2) 式中： RD 相对相差 ， 用百分比 （ %）表示； X1、 X2 两个 检材 样品 平行定量测定的含量数值； X 两个 检材 样品 平行定量测定含量的平均值。 8 分析结果评价 8.1 定性结果评 价 8.1.1 气相色谱 -质谱 阳性结果评价：在相同条件下进行样品测定时，检材样品中目标物的色谱峰保留时间与标准溶液一 致（相对误差在 1%之内），且在扣除背景后的检材样品质谱图中，目标物的质谱特征离子（不少于 3 个）与标准溶液一致，特征离子丰度比与浓度接近
21、的标准溶液相比，相对偏差不超过表 4 规定的范围， 空白样品无干扰，则可判断检材样品中检出目标物。 灭多威和灭多威肟的 GC-MS 相关谱图参见附录 A 中图 A.1图 A.3。 表 4 特征离子丰度比的最大允许相对偏差范围 特征离子丰度比 50% 20 50 10 20 10% 最大允许相对偏差 10 15 20% 50% 阴性结果评价： 检材样品未出现与目标物标准溶液一致的色谱峰，且添加样品中出现与目标物标准 溶液一致的色谱峰，空白样品无干扰，则可判断检材样品中未检出目标物。 GC-MS 方法检出限参见附 录 A。 8.1.2 液相色谱 -质谱 阳性结果评价：在相同条件下进行样品测定时，检
22、材样品中目标物的色谱峰保留时间与标准溶液一 致（相对误差在 2.5%之内）、目标物的定性离子（至少两对定性离子）与标准溶液一致，且离子丰度 比与浓度接近的标准溶液相比，相对偏 差不超过表 5 规定的范围，空白样品无干扰，则可判断检材样品 中检出目标物。 灭多威和灭多威肟的 LC-MS 相关谱图参见附录 A 中图 A.4 和 图 A.5。 表 5 离子丰度比的最大允许 相对 偏差范围 离子丰度比 50% 20 50 10 20 10% 最大允许相对偏差 20 25 30% 50% 阴性结果评价：检材样品未出现与目标物标准溶液一致的色谱峰，且添加样品中出现与目标物标准 溶液一致的色谱峰，空白样品无
23、干扰，则可判断检材样品中未检出目标物。 LC-MS 方法检出限参见附 录 A。 8.2 定量结 果评价 如果目标物含量的 RD 20%，定量数据可靠，其含量按两份检材的平均值计算。如果检材样品中 目标物含量的 RD 20%，定量数据不可靠。应按 7.2重 新提取检验。 GA/T 7 附 录 A （资料性附录） 灭多威 和灭多威肟 相关资料 A.1 灭多威（分子式为 C5H10N2O2S， 又名万灵、快灵 ， CAS： 16752-77-5） ， 是一种高毒广谱型氨基甲 酸酯类杀虫剂，并具有药效迅速、渗透力强、分解快、残留低等特点。在通风时、日光下、碱性介质中 或在较高温度下迅速分解成灭多威肟
24、（分子式为 C5H10N2O2S） ， 其分解过程如下： CH 3 C N O C N H C H 3 CH 3 C N OH SC H 3 O SC H 3 OH 灭多威 灭多威肟 灭多威 灭多威肟 A.2 灭多威 和灭多威肟 的 GC-MS 总离子流 图见图 A.1。 图 A.1 GC-MS分析灭多 威（ 2g/L） 总离子流 图 A.3 灭多威 和 灭多威肟 的 特征 离子质谱 图 分别 见图 A.2 和 图 A.3。 图 A.2 灭多威特征 离子质谱 图 GA/T 8 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 0 10 20 30 40 50
25、 60 70 80 90 100 % 58 105 8842 207 324 391182 546457128 300 367 488416261 510 图 A.3 灭多威肟特征 离子质谱 图 A.4 灭多 威的 LC-MS色谱 质谱图见图 A.4。 50n g ST 10-D ec-201023 : 22: 14 T i m e 0 .2 0 0 .4 0 0 .6 0 0 .8 0 1 .0 0 1 .2 0 1 .4 0 1 .6 0 1 .8 0 2 .0 0 2 .2 0 2 .4 0 2 .6 0 2 .8 0 3 .0 0 3 .2 0 3 .4 0 % 0 0 .2 0 0
26、.4 0 0 .6 0 0 .8 0 1 .0 0 1 .2 0 1 .4 0 1 .6 0 1 .8 0 2 .0 0 2 .2 0 2 .4 0 2 .6 0 2 .8 0 3 .0 0 3 .2 0 3 .4 0 % 0 0 .2 0 0 .4 0 0 .6 0 0 .8 0 1 .0 0 1 .2 0 1 .4 0 1 .6 0 1 .8 0 2 .0 0 2 .2 0 2 .4 0 2 .6 0 2 .8 0 3 .0 0 3 .2 0 3 .4 0 % 0 20101210M ethom y l S T D - 10 M RM o f 2 Ch a n n e l s ES+ 1
27、6 2 .9 6 4 1 0 5 .9 7 7 (M e th o m y l ) 7 .2 3 e 5 1 .2 0 20101210M ethom y l S T D - 10 M RM o f 2 Ch a n n e l s ES+ 1 6 2 .9 6 4 8 7 .9 4 9 (M e th o m y l ) 1 .0 0 e 6 1 .2 1 20101210M ethom y l S T D - 10 M RM o f 2 Ch a n n e l s ES+ T IC (M e th o m y l ) 1 .6 9 e 6 1 .2 0 图 A.4 灭多威 LC-MS色谱
28、质谱图 A.5 灭多 威肟的 LC-MS色谱 质谱图见图 A.5。 mi ed u o w ei w u ST T i m e 0 .5 0 1 .0 0 1 .5 0 2 .0 0 2 .5 0 3 .0 0 3 .5 0 4 .0 0 4 .5 0 % 0 100 0 .5 0 1 .0 0 1 .5 0 2 .0 0 2 .5 0 3 .0 0 3 .5 0 4 .0 0 4 .5 0 % 0 100 0 .5 0 1 .0 0 1 .5 0 2 .0 0 2 .5 0 3 .0 0 3 .5 0 4 .0 0 4 .5 0 % 0 100 20171121- 2 M RM o f 2
29、Ch a n n e l s ES+ 1 0 5 .9 6 8 7 2 .8 5 (m i e d u o w e i w u ) 8 .9 8 e 4 Are a 1 .0 5 2088 20171121- 2 M RM o f 2 Ch a n n e l s ES+ 1 0 5 .9 6 8 5 7 .9 7 7 (m i e d u o w e i w u ) 1 .5 7 e 7 Are a 1 .0 5 377997 1 .0 8 3260 20171121- 2 M RM o f 2 Ch a n n e l s ES+ T IC (m i e d u o w e i w u ) 1 .5 8 e 7 Are a 1 .0 5 380089 1 .0 8 3278 图 A.5 灭多威肟 LC-MS色谱质谱图 GA/T 9 A.6 GC-MS分析，灭多威和灭多威肟的检出限 均为 500ng/ mL（ g） ； LC-MS分析，灭多威和灭多威肟 的检出限均为 10ng/mL（ g）。 _
