1、 ICS 13.310 A 92 中 华 人 民 共 和 国 公 共 安 全 行 业 标 准 GA GA/T 法庭科学 生物 检材 中 草甘膦 检验 离子 色谱 -质谱法 Forensic sciences Examination methods for glyphosate in biological samples IC-MS - - 发布 - -实施 中华人民共和国公安部 发布 GA/T I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技
2、术委员会（ SAC/TC 179/SC 1） 提出并 归口。 本标准起草单位：公安部物证鉴定中心、浙江省公安厅、山东省公安厅。 本标准主要起草人：侯小平、 任昕昕、 栾玉静、于忠山、傅 得锋 、高宏、张广华。 GA/T 1 法庭科学 生物检材 中 草甘膦 检验 离子 色谱 -质谱法 1 范围 本标准规定了 法庭科学 生物检材 （血、尿、肝、肾、胃及胃内容等） 中 草甘膦 的 离子色谱 -质谱 （ IC-MS/MS） 定性定量 检验 方法。 本标准适用 于 法庭科学 生物检材中 草甘膦 的定性 分析和 定量 分析 。 其他 可疑 样品 中草甘膦 的 定性 分 析和定量分析 可参照使用。 2 规范
3、性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本文件。 4 原理 以 空白样品和添加样品作对照，按平行操作的要求，对生物检材进行提取 及 净化 ，采用 离子色谱 - 质谱 法 定性 定量 ，以保留时间、质谱特征离子和相对丰度 比 作为定性判断依据；以峰面积为依据，采用 外标法进行定量分析。 5 试剂 和 材料 5.1 试剂 实验用
4、水应符合 GB/T 6682 中规定的一级水，试剂包括： a) 乙腈（色谱纯） ； b) 标准 溶液 ： 1） 1.0mg/mL 标准 物质溶 液： 根据 草甘膦 标准物质的纯度 和盐型换算后 ， 称取适量， 用水配 制 1.0mg/mL 草甘膦标准物质溶液，置于冰箱中冷藏保存。有效期 6 个月。 或采用市售标 准溶液 ； 2） 10.0g/mL 标准 工作溶液 ： 移取 1.0mg/mL 的 草甘膦 标准物质溶液 0.1mL，用甲醇稀释至 10mL，混匀 ， 密封，置于冰箱中冷藏保存 。 有效期 3 个月。 实验中所用其他浓度的标准 工作溶液均由 10.0g/mL 标准物质溶液用甲醇稀释得到
5、。 注 ： 特殊情况下可使用对照溶液代替标准溶液 。 5.2 材料 GA/T 2 材料 包括 ： a) 具盖离心管； b) 具塞玻璃试管； c) 容量瓶； d) 水系微孔滤膜： 0.22m； e) 离子色谱样品前处理净化柱： Dionex OnGuard RP 柱或等效柱。 注 ： Dionex OnGuard RP柱是 Thermo公司产品 的商品名称 ，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表 示对该产品的认可。如果其 他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 6 仪器和设备 仪器和设备包括： a) 离子 色谱 -质谱仪： 配有 离子色谱仪 、 电喷雾离子源（ ESI）和三重
6、四极杆质量分析器； b) 电子 天平； c) 离心机； d) 涡旋振荡器； e) 移液器 ； f) 浓缩器 。 7 操作方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品 提取 7.1.1.1 沉淀蛋白 移取血液等液体 检材 样品 1.0mL 2.0mL，或称取铰碎的肝脏等固体 检材 样品 1.0g 2.0g 于具盖离 心管中 ， 加入 乙腈 2.0mL 4.0mL， 振荡 10min， 8000r/min 离心 20min， 分离 上清液 ，用 去离子水稀释 5 倍 ， 稀释液 过离子色谱样品前处理净化柱净化，将最先流出的 3mL 液体弃去后， 收集 剩余 的 流出液， 经 水系 微孔滤膜过滤， 作为
7、检材样品提取液 供仪器分析。 7.1.1.2 质控 样品制备 取等量相似基质的空白样品（若无相似基质空白样品可用血液替代）两份于具盖离心管中，一份作 为空白样品， 一份添加草甘膦标准物质 ，作为添加样品（ 添加样品的浓度为 1.0g/mL(g)） 与检材样品 平行操作，得到空白样品提取液和添加样品提取液供仪器 分析 。 7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 仪器条件 以下为参考 条件 ， 可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整 ： a) 色谱柱： Dionex IonPac AS11-HC型 阴离子 分析柱 (250mm2mm)及 Dionex IonPac AG11-HC 型 阴离子
8、 保护柱 (50mm2mm)或 其他 等效柱 ； 注： Dionex IonPac AS11-HC 型 阴离子 分析柱及 Dionex IonPac AG11-HC 型 阴离子 保护柱色谱柱 均 为 Thermo 公 司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产 品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 淋洗液 ： 80mmol/L氢氧化钾 ； GA/T 3 c) 柱温： 30 ； d) 流速： 0.3mL/min； e) 离子源：电喷雾电离（ ESI）； f) 检测方式： 负 离子 ； g) 毛细管电压： -4.5kV； h) 雾化气
9、 温度： 550 ； i) 雾化气： 60psi； j) 扫描模式：多反应离子监测（ MRM）； k) MS参考条件 （ 定性、 定量离子对 、去簇电压、碰撞能 ） 见 表 1。 表 1 MS 参考条件 中文名称 定量离子对 定性离子 对 去簇电压 V 碰撞能量 eV 草甘膦 168.0 63.0 168.0 63.0 -30.0 -35.0 168.0 150.0 -17.0 168.0 78.9 -55.0 7.1.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液及标准工作溶液， 按 7.1.2.1 的 分析条件进样分析。 7.2 定量分析 7.2.1 样品 提取 移取血液等液体检材样品
10、1.0mL 2.0mL 两 份，或称取铰碎的肝脏等固体检材样品 1.0g 2.0g 两 份，按 7.1.1进行操作； 另取等量 相似 基质的空白样品 三 份， 其中 两份分别添加 草甘膦 标准 物质 ， 作为添加样品 （ 添加样品 中目标物含量应为检材 样品 中目标物含量的 (10050)% ），另一份 作为空白样品，与检材 样品平行 操 作 ， 得到 空白样品提取液和添加样品提取液供仪器 分析 。 7.2.2 仪器检测 7.2.2.1 仪器条件 按 7.1.2.1 规定的条件分析。 7.2.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液 及 标准工作溶液， 按 7.1.2.1的分析条件每个
11、样品进样分析 2 3次。若要报告测量不确定度，每个样品分析次数应不少于 6次 。 7.2.3 计算 7.2.3.1 计算 含量 记录各样品 提取液 平行进样 2 3 次 的 目标物 保留时间和 峰面积值，按公式（ 1）计算含量： 添样添 样添样 VMA VMAW = . (1) 式中： W 检材 样品中目标物 的含量，单位为微克每克（ g/g）或微克每毫升（ g/mL）； GA/T 4 A 样 检材 样品 提取液 中目标物峰面积平均值； M 添 添加 样品中 目标物 添加量，单位为微克（ g）； V 样 检材 样品的定容体积，单位为毫升（ mL）； A 添 添加 样品 提取液 中目标物峰面积平
12、均值； M 样 检材 样品的取样量，单位为克（ g）或毫升（ mL）； V 添 添加 样品的定容体积，单位为毫升（ mL）。 7.2.3.2 计算 相对相差 记录两份平行操作的检材样品 中目标物的 含量，按公式（ 2）计算相对相差： %1 0 021 = X XXRD . (2) 式中： RD 相对相差 ， 用百分比（ %）表示； X1、 X2两个检材 样品平行定量测定的含量数值； X 两 个 检材 样品平行 定量测定含量的平均值。 8 结果评价 8.1 定性结果评价 8.1.1 阳性结果评价 在相同条件下进行样品测定时，检材样品中目标物的色谱峰保留时间与标准溶液一致（相对误差在 2.5%之内
13、）、目标物的定性离子（至少两对定性离子）与标准溶液一致，且离子丰度比与浓度接近的 标准溶液相比，相对偏差不超过表 2规定的范围，空白样品无干扰，则可判断检材样品中检出目标物。 草甘膦的相关图谱 参 见附录 A。 表 2 离子丰度比的最大允许 相对 偏差范围 离子丰度比 50% 20 50 10 20 10% 最大允许相对偏差 20 25 30% 50% 8.1.2 阴性结果评价 检材样品未出现与目标物标准溶液一致的色谱峰，且添加样品中出现与目标物标准溶液一致的色谱 峰，空白样品无干扰，则可判断检材样品中未检出目标物。 本 方法检出限参见附录 A。 8.2 定量结果评价 如果目标物含量的 RD
14、20%，定量数据可靠，其含量按两份检材的平均值计算。如果检材样品中 目标物含量的 RD 20%，定量数据不可靠。应按 7.2重新提取检验。 草甘膦中毒诊断参考资料参见附录 B。 GA/T 5 附 录 A （资料性附录） 草甘膦 的 相关 谱 图 A.1 草甘膦的 离子 色谱 -质谱 图见图 A.1。 X I C o f - M R M ( 5 p a i r s ) : 1 6 8 . 0 0 0 / 6 3 . 0 0 0 D a f r o m S a m p l e 1 0 ( G L Y 1 0 n g / m L ) o f D a t a 2 0 1 8 0 3 0 1 . w i
15、 f f ( T u r b o S p r a y ) , S m o o t h e d , S m o o t h e . . . M a x . 1 7 7 9 . 9 c p s . 0 . 5 1 . 0 1 . 5 2 . 0 2 . 5 3 . 0 3 . 5 4 . 0 4 . 5 5 . 0 5 . 5 6 . 0 6 . 5 7 . 0 7 . 5 8 . 0 8 . 5 9 . 0 9 . 5 T i m e , m i n 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600
16、1700 1780 In te ns ity , c ps 3 . 1 0 3 . 5 7 3 . 8 7 4 . 2 6 5 . 0 9 4 . 9 8 7 . 0 1 9 . 5 07 . 4 65 . 6 70 . 6 1 1 . 3 3 5 . 5 6 9 . 2 76 . 4 92 . 4 5 7 . 7 12 . 7 40 . 4 9 1 . 6 5 2 . 2 9 9 . 8 50 . 7 6 X I C o f - M R M ( 5 p a i r s ) : 1 6 8 . 0 0 0 / 1 5 0 . 0 0 0 D a f r o m S a m p l e 1 0
17、( G L Y 1 0 n g / m L ) o f D a t a 2 0 1 8 0 3 0 1 . w i f f ( T u r b o S p r a y ) , S m o o t h e d , S m o o t h e . . . M a x . 9 9 6 . 1 c p s . 0 . 5 1 . 0 1 . 5 2 . 0 2 . 5 3 . 0 3 . 5 4 . 0 4 . 5 5 . 0 5 . 5 6 . 0 6 . 5 7 . 0 7 . 5 8 . 0 8 . 5 9 . 0 9 . 5 T i m e , m i n 0 50 100 150 200 2
18、50 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 996 Inte ns ity , c ps 3 . 0 9 3 . 9 43 . 6 2 4 . 1 3 5 . 0 3 6 . 2 15 . 2 94 . 9 51 . 3 0 5 . 8 8 6 . 9 9 7 . 2 0 7 . 7 3 9 . 4 58 . 5 42 . 3 0 5 . 7 5 6 . 8 11 . 7 6 8 . 4 3 8 . 6 8 9 . 2 91 . 0 30 . 8 0 9 . 5 62 . 4 60 . 5 5 X I C o f - M
19、 R M ( 5 p a i r s ) : 1 6 8 . 0 0 0 / 7 8 . 9 0 0 D a f r o m S a m p l e 1 0 ( G L Y 1 0 n g / m L ) o f D a t a 2 0 1 8 0 3 0 1 . w i f f ( T u r b o S p r a y ) , S m o o t h e d , S m o o t h e d , . . . M a x . 8 1 8 . 1 c p s . 0 . 5 1 . 0 1 . 5 2 . 0 2 . 5 3 . 0 3 . 5 4 . 0 4 . 5 5 . 0 5 . 5
20、 6 . 0 6 . 5 7 . 0 7 . 5 8 . 0 8 . 5 9 . 0 9 . 5 T i m e , m i n 0 50 100 150 200 250 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 In te ns ity , c ps 3 . 0 9 3 . 6 9 3 . 7 9 4 . 1 5 4 . 9 2 5 . 8 0 6 . 2 1 8 . 1 00 . 4 0 5 . 0 91 . 3 61 . 1 7 6 . 4 7 7 . 1 51 . 9 5 9 . 3 44 . 6 8 2 . 6 3 7 . 4 4 8 . 9 0
21、 9 . 5 78 . 3 4 图 A.1 草甘膦 的 离子 色谱 -质谱 图 A.2 IC-MS分析，草甘膦检出限为 0.5g/ mL（ g）。 GA/T 6 附 录 B （资料性附录） 草甘膦 的 中毒诊断参考资料 B.1 理化性质 草甘膦（ Glyphosate， CAS:1071-83-6），化学名称： N-（ 膦酸甲基 ） 甘氨酸。 纯 品为 非挥发性 白 色晶 体 。 25 时在 水 中的溶解度为 1.2%，不溶于 一般有机溶剂 ， 其异丙胺盐 完全溶解于水。 不可燃、 不爆炸。常温贮存稳定。 B.2 毒性 草甘膦的大鼠急性经口 LD50为 4320mg/kg，小鼠经口 LD50为
22、 4640mg/kg，兔急性 经皮 LD50大于 2000mg/kg，对人、畜低毒。急性毒性为 级，属低毒除草剂。 B.3 中毒症状 草甘膦急性中毒基本由经口误服所致，生产和使用中引起全身急性中毒罕见。急性草甘膦中毒的 常见临床表现有恶心、呕吐、头昏、乏力、腹痛、面色苍白，有的病例还可见血压降低、昏迷和呼吸心 跳骤停。草甘膦制剂对皮肤、黏膜有酸蚀刺激作用，甚至可引起轻度灼伤；小剂量草甘膦的摄入可刺激 口腔黏膜、咽喉，可出现轻微、短暂的胃肠功能损伤，经口大量摄入可致胃肠道发生化学腐蚀性炎症。 草甘膦暴露的职业人群可出现眼部和皮肤刺激症状，还有诸如 心动过速、血压升高、恶心和呕吐等症状。 B.4
23、人体内代谢 草甘膦经口吸收率为 30% 36%，进入人体后，维持时间较短，在 （ 2 6） h达最大浓度。放射性 核素提示草甘膦进入机体内主要分布在小肠、结肠、肾脏、骨骼，其中小肠内的浓度最高。草甘膦进入 机体内几乎不发生生物转化，约 90%经粪便排出，约 10%经肾排出。草甘膦经皮肤吸收率约为 2%。 B.5 中毒死亡机理 多数学者认为草甘膦中毒机制是使细胞线粒体氧化磷酸化作用受阻 二磷酸腺苷不能转化为能量 三磷酸腺苷细胞缺少能量发生坏死从而引起组织损害及功能衰竭。 体外和 体内试验都已证明 ，肝脏 （ 肝 细胞 ） 是草甘膦主要的靶器官之一 。 有研究显示，用 （ 60 180） mg/L
24、 的草甘膦制剂处理人 L-02 肝细 胞，可引起 L-02 肝细胞的存活率下降，细胞膜的通透性和完整性改变，诱发细胞核线粒体损伤，使细 胞凋亡和坏死 。 研究低浓度的草甘膦暴露对人体胎盘人绒毛膜癌 (JEG3) 细胞的毒性作用，发现其不仅 可以降低细胞色素 P450 芳香酶的活性，还可以抑制相关还原酶，是潜在的环境内分泌干扰物 有研究 显示，体外处理人外周血单核细胞，出现干扰素 - ( IFN- )和白细膜介素 - 2（ IL- 2） 的降低， 说明高浓度 的草甘膦可能通过抑制多种细胞因子的释放，对机体产生免疫抑制 此外，有研究发现，即使是低剂量 的草甘膦也可能损伤人体细胞 DNA，导致人体淋巴细胞姐妹染色单体交换 （ SCE） 频率升高，并且女 性的 DNA 更容易受到损伤 。 _
