1、ICS 13.310 A 92 GA 中 华 人 民 共 和 国 公 共 安 全 行 业 标 准 GA/T 法庭科学 疑似毒品中可卡因检验 液相色谱和液相色谱 -质谱法 Forensic sciences Examination methods for cocain in suspected drugs LC and LC-MS - - 发布 - - 实施 中华人民共和国公安部 发布 GA/T I 前 言 本 标准 按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本 标准 由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分
2、析分技术委员会 （ SAC/TC 179/SC 1） 提出并归口。 本标准起草单位：公安部物证鉴定中心 、福建省 公安厅 。 本标准主要起草人： 高利生 、张春水、郑珲、 翟晚枫、 李航麒 、 常颖、赵阳、 贺剑锋、 刘克林、黄 星、王一、王 蔚 昕 、赵彦彪、李彭 、杨虹贤、郑晓雨 。 GA/T 1 法庭科学 疑似毒品中可卡因检验 液相色谱和液相色谱 -质谱法 1 范围 本标准 规定了 法庭 科学领域疑似毒品中 可卡因的 液 相色谱 -质谱 （ LC-MS）定性 检验 方法 和 液 相色 谱（ LC）定量 检验 方法 。 本标准 适用于 法庭科学 领域疑似毒品 中可卡因的定性 分析 和 定量
3、 分析 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 4883 2008 数据的统计处理和解释 正态样本离群值的判断和处理 GB/T 6682 分析 实验室用水规格和试验方法 JJF 1059.1 2012 测量不确定度评定与表示 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本 文件 。 4 原理 对疑似毒品样品中的 可卡因 进行提取 。 采 用 液相色谱 -质谱 检测，以保留时间 、 质谱特征离子碎
4、片 峰 和 离子 丰度 比 作为定性判断依据； 采 用 液相色谱检测， 用标准曲线法进行定量分析 。 5 试剂和材料 5.1 试剂 实验用水应符合 GB/T 6682 中规定的一级水。除非另有说明，在分析中使用的 试剂 均为 色谱 纯， 试 剂包括： a） 乙腈； b） 甲醇； c） 甲酸； d） 水合磷酸二氢钠 ：分析纯 ； e） 浓磷酸； f） 三乙胺； g） 内标物： 二苄胺 ； h） 标准溶液： 1） 标准物质溶液： 1.0mg/mL可卡因标准物质溶液； GA/T 2 2） 标准工作溶液按实验需求分为以下三类： 定性用标准工作溶液： 移取 1.0mg/mL的 可卡因标准物质溶液适量 ，
5、用甲醇稀释，配 制成 1ng/mL的 可卡因 标准工作溶液 。其余浓度定性用标准工作溶液，按实验需求由 1.0mg/mL的可卡因标准物质溶液稀释配制； 外标法用标准工作溶液：使用 1.0mg/mL可卡因标准物质溶液 ， 用甲醇逐级稀释 ，配 制 成 0.5mg/mL、 0.1mg/mL、 0.05mg/mL、 0.01mg/mL、 0.005mg/mL的 可卡因 标准工作 溶液； 内标法用标准工作溶液： 称取 二苄胺 500mg，用甲醇定容到 50mL容量瓶中，配制成 10.0mg/mL二苄胺 内标储备溶液（置于冰箱中保存， 有效期 12个月）。使用时用甲醇 稀释，配制成 0.5mg/mL的
6、二苄胺 溶液 。内标法用标准工作溶液 制备方法参见附录 A 中表 A.1，移取相应体积的 1.0mg/mL可卡因标准物质溶液 、 0.5mg/mL二苄胺 溶液至 1mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度， 配制可卡因 浓度分别为 0.5mg/mL、 0.1mg/mL、 0.05mg/mL、 0.01mg/mL、 0.005mg/mL的 可卡因 标准 工作溶液。 5.2 材料 材料包括： a） 具盖 离心管； b） 有机 系 微孔滤膜 ： 0.22m。 6 仪器和设备 仪器和 设备 包括： a） 液相色谱仪（ LC） ： 配有二极管阵列 （ DAD） 或紫外检测器 （ UV） ； b） 液相色谱 -质谱
7、仪（ LC-MS） ： 配电喷雾离子源 、 三重 四 极 杆质量分析器 ； c） 电子天平 ： 分度值 d： 0.01mg； d） 离心机； e） 涡旋振荡器； f） 真空抽 滤 泵； g） 超声清洗仪； h） 10mL和 1mL移液器或移液管； i） 10mL瓶口移液器。 7 操作方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品 提取 称取样品约 10mg于具盖离心管中 ，加入 10mL甲醇，密封并振荡 10min， 6000r/min离心 5min， 离心 后 取出适量上清液 稀释， 用 0.22m的 有机 系 微孔滤膜 过滤 ， 供 LC-MS分析。 同时用 LC-MS分析 定性用 标准工作溶液
8、进行质量控制。 7.1.2 仪器检测 GA/T 3 7.1.2.1 液相色谱 -质谱仪条件 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整： a） 色谱柱： poroshell 120 C18 （ 3.0mm50mm,2.7m） 或其他等效柱 ； 注： poroshell 120 C18 柱为 Agilent 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示 对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b） 流动相 ： A： 0.2%甲酸 溶液 ， B：甲醇； c） 梯度程序： 见表 1； 表 1 梯度洗脱程序 时间 min A
9、B 0 70% 30% 3 40% 60% 3.01 5% 95% 3.5 5% 95% d） 流速： 0.3mL/min； e） 离子源：电喷雾离子源； f） 扫描方式：正离子模式； g） 毛细管 电压： 4000V； h） 干燥气： 10 L/min； i） 干燥气温度： 350 ； j） 雾化气： 25psi； k） 后处理时间（平衡时间）： 3.5min； l） 后处理流速： 0.4mL/min； m） 可卡因的 离子对和 Fragmentor电压、碰撞能量 (CE)：见表 2。 表 2 质谱参考 条件 名称 母离子 子离子 Fragmentor 电压 V 碰撞能量 eV 可卡因 30
10、4.2 182.0 115 19 150.0 26 7.1.2.2 进样 分别吸取（空白）甲醇溶液、 定性用标准工作溶液 和样品提取液适量，按 7.1.2.1条件进样分析。 7.1.3 记录 分别记录标准物质和 样品中目标物 的 保留时间 、 定性离子对 及 离子 丰度 比 。 7.2 定量分析 7.2.1 外标法 GA/T 4 7. 2.1.1 标准 工作曲线绘制 按照 7.2.1.4.1条件分析 外标法用标准工作溶液 ， 以溶液中目标物的峰面积值为纵坐标，目标物浓度 为横坐标， 绘制成线性范围为 0.005mg/mL 0.5mg/mL的 可卡因 标准工作曲线。 7.2.1.2 标准工作曲线
11、监测 采用 浓度为 0.01mg/mL和 0.5mg/mL的 外标法用 标准工作溶液作为监测样品，建立标准工作曲线时， 每个监测样品各分析 10次，计算可卡因峰面积的平均值及标准偏差（ SD）。每次检验前先分析监测样 品， 监测样品的结果在平均值 3SD之间， 标准工作曲线有效 ； 监测样品的结果 超出 平均值 3SD，应重 新绘制标准工作曲线。 7.2.1.3 样品提取 平行称取样品 2份各约 10mg于具盖离心管中 （如需提供定量结果的不确定度，则平行称取样品 6份）， 加入 10mL甲醇， 密封并振荡 10min， 6000r/min离心 5min，离心后取出适量上清液稀释，用 0.22
12、m的有 机系微孔滤膜过滤 ，供 LC-DAD或 LC-UV分析。 可根据实验情况调整样品称量重量 。 7.2.1.4 仪器检测 7.2.1.4.1 液相色谱仪 条件 以下为参考条件，按照本 方 法所获得的液相色谱图参见附录 B，可根据不同品牌仪器和不同样品等 实际情况进行调整： a） 检测器：二极管阵列或可变波长紫外检测器； b） 色谱柱： ODS， （ 150mm4.6mm,5m） ； c） 柱温： 40 ； d） 缓冲液： 磷酸缓冲溶液（ 36 mmol/L， 0.25%三乙胺 v/v）。以配制 2000mL 为例：称取水合磷酸 二氢钠固体 11.4g，量取浓磷酸 5mL 及 三乙胺 5m
13、L，用 水定容至 2000mL 的容量瓶中，摇匀。 用真空抽 滤 泵 过滤 ，超声清洗仪 超声，即可使用； e） 流动相： A：缓冲液， B：乙腈； f）梯度程序： 见表 3； 表 3 梯度洗脱程序 时间 min A B 0 87% 13% 7 83.5% 16.5% 20 83.5% 16.5% g） 流速： 1.0mL/min； h） 检测波长 ： 220nm，带宽： 4nm。 7.2.1.4.2 进样 分别吸取（空白）甲醇溶液、 外标法用标准工作溶液 和样品提取液 适量 ，按 7.2.1.4.1条件进样分析。 7.2.1.5 计算 GA/T 5 7.2.1.5.1 计算含量 用标准工作曲
14、线和公式（ 1）对样品进行定量，计算 含量 Xi。 100% iiVXC m= （ 1） 式中： Xi 样品中目标物含量 ， 用百分比（ %）表示 ； Ci 从标准曲线上得到的目标物浓度，单位为毫克每毫升（ mg/mL）； V 样品的定容体积 （含稀释倍数） ，单位为毫升（ mL）； m 样品的取样量，单位为毫克（ mg）。 7.2.1.5.2 计算 相对相差 对两个平行测定数据按照公式（ 2）进行相对相差（ RD）计算。 100%12 0 X - XRD = X （ 2） 式中： 相对相差， 用百分比（ %）表示 ； 1、 2 两个样品平行定量测定的含量数值； 0 两个样品平行定量测定 的
15、含量平均值。 7.2.1.5.3 异常值检验 根据 GB/T 4883 2008， 按照公式（ 3）对 6份（ 或 5份）平行测定数据进行 格拉布斯（ Grubbs） 可疑 值判别。 i0i X -XG= s （ 3） 式中 ： 可疑值 ； 0 平均值 ； 6 个（或 5 个）数据的单次测定标准差 ； Grubbs 统计量。 7.2.2 内标法 7.2.2.1 标准 工作曲线绘制 按照 7.2.1.4.1 条件分析 内标法用标准工作溶液 ， 记录 目标物和 二苄胺 的峰面积，以峰面积比值为纵 坐标，浓度比值为横坐标， 绘制成线性范围为 0.005mg/mL 0.5mg/mL 的 可卡因 标准
16、工作曲线 。 7.2.2.2 标准工作曲线监测 采用 可卡因 浓度为 0.01mg/mL和 0.5mg/mL的 内标法用标准工作溶液 作为监测样品，建立标准工作曲 线时，每个监测样品各分析 10次，计算 可卡因 与二苄胺峰面积比值的平均值及 SD。每次检验前先分析 GA/T 6 监测样品， 监测样品的结果在平均值 3SD之间， 标准工作曲线有效 ； 监测样品的结果 超出 平均值 3SD， 应重新绘制标准工作曲线。 7.2.2.3 样品制备 平行 称取样品 2 份各约 10mg 于具盖离心管中 （如需提供定量结果的不确定度，则平行称取样品 6 份），加入 10mL 甲醇，充分振荡，离心后移取上清
17、液 500L 于 1mL 容量瓶中，向容量瓶中加入 0.5mg/mL 二苄胺 100L，用甲醇定容至刻度，振荡均匀后 用 0.22m 有机 系 微孔滤膜 过滤 ，供 LC-DAD 或 LC-UV 分析。 可根据实验情况调整样品称量重量 。 7.2.2.4 仪器检测 7.2.2.4.1 液相色谱仪 条件 同 7.2.1.4.1。 7.2.1.4.2 进样 分别吸取（空白）甲醇溶液、 内标法用标准工作溶液 和加入内标的样品提取液 适量 ，按 7.2.2.4.1条 件进样分析。 7.2.2.5 记录与 计算 7.2.2.5.1 含量计算 用标准工作曲线和公式（ 4）对样品进行定量，计算 含量 Xi。
18、 100% i VX k C m= 内 (4) 式中： Xi 样品中目标物含量 ， 用百分比（ %）表示 ； k 从标准曲线上得到的目标物和内标的浓度比； C 内 内标浓度，单位为毫克每毫升（ mg/mL）； V 样品的定容体积 （含稀释倍数） ，单位为毫升（ mL）； m 样品的取样量，单位为毫克（ mg）。 7.2.2.5.2 计算 相对相差 同 7.2.1.5.2。 7.2.2.5.3 异常值检验 同 7.2.1.5.3。 8 结果评价 8.1 定性结果评价 阳性结果评价：在相同条件下进行样品测定时， 样品中目标物的色谱峰保留时间与 浓度接近的定性 用 标准 工作 溶液一致（相对误差在
19、2.5%之内）、目标物的定性离子（至少两对定性离子）与 浓度接近 GA/T 7 的定性用 标准 工作 溶液 一致，且离子丰度比与浓度接近的 定性用 标准 工作 溶液相比，相对偏差不超过表 4规定的范围，空白 甲醇溶液 无干扰，则可判断 样品中检出目标物。 表 4 离子丰度比的最大允许偏差范围 离子丰度比 50% 20 50 10 20 10% 最大允许相对偏差 20 25 30% 50% 阴性结果评价： 样品未出现与 1ng/mL 定性用标准工作 溶液一致的色谱峰，空白 甲醇溶液 无干扰， 则可判断检材样品中未检出目标物。 LC-MS 分析，最小检测限为 1ng/mL。 8.2 定量结果评价（
20、外标法及内标法） 8.2.1 含量结果有效性 对两个平行测定数据进行相对相差（ RD）计算， 当 RD10%时 ，数据有效； 当 RD 10%时 ，需要 重新检验。 8.2.2 异常值检验 对 6份（ 5份）平行测定数据进行 Grubbs可疑值判别， GiGn（ 95） 时 ， 数据有效， GiGn（ 95） 时， 应剔 除该数据，但只能剔除 1个数据，否则本次测定无效，需要重新检验。 当测定次数 n=6 时 ， G6（ 95） =1.822；当测定次数 n=5 时， G5（ 95） =1.672。 8.2.3 含量结果计算 以 2 份样品含量测定的平均值作为含量结果（ 如需提供定量结果的不确
21、定度，则以 6 份或 5 份样品 含量测定的平均值作为含量结果）。 8. 3 含量结果表述 定量检验完成后，检验结果应表述为：从样品中检出 可卡因 成分，其中 可卡因 含量为 . %。 8. 4 测量不确定度的评定与表述 如需提供测量不确定度，测定结果的不确定度评定与表述按 JJF 1059.1 2012的规定执行。 GA/T 8 附录 A （资料性附录） 内标定量法 标准溶液制备操作参数 内标 法 用 标准 工作 溶液制备操作参数选择见表 A.1。 表 A.1 内标 定量法标准溶液制备操作参数选择表 浓度级别 1.0mg/mL 可卡因标准 物质溶液 体积 L 0.5mg/mL 二苄胺 溶 液
22、 体积 L 定容体积 mL 可卡因浓度 mg/mL 5 100 1 0.005 10 100 1 0.01 50 100 1 0.05 100 100 1 0.1 500 100 1 0.5 GA/T 9 附录 B （资料性附录） 可卡因 相关谱图 可卡因 的液相色谱图和特征离子质量色谱图见图 B.1 和图 B.2。 图 B.1 可卡因 液相色谱图 图 B.2 可卡因 特征离子质量色谱 图 0 . 0 2 . 5 5 . 0 7 . 5 1 0 . 0 1 2 . 5 1 5 . 0 1 7 . 5 m i n -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 m A U 2 2 0 n m , 4 n m ( 1 . 0 0 ) 可卡因 /1 7 .5 3 9
