1、以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5227.10 2019 出口食品中貂源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法） Rapid detection of marten derived ingredient in food for export Recombinase-aid amplification (RAA) method 2019-12-27发布 2020-07-01 实施 ICS 67.050 C 53 中华人民共和国海关总署发 布 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 SN/T 5227.102019 I 前 言 SN/T 5227
2、2019出口食品中动物源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）预计分为以下部分： 第 1 部分：出口食品中鸡源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）； 第 2 部分：出口食品中猪源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）； 第 3 部分：出口食品中羊源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）； 第 4 部分：出口食品中鸭源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）； 第 5 部分：出口食品中牛源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）； 第 6 部分：出口食品中水牛源性成分快速检测 重组酶介导链替
3、换核酸扩增法（RAA 法）； 第 7 部分：出口食品中马源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）； 第 8 部分：出口食品中驴源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）； 第 9 部分：出口食品中狐狸源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）； 第 10 部分：出口食品中貂源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）； 第 11 部分：出口食品中大鼠源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）。 本部分为 SN/T 52272019 第 10 部分。 本部分是根据 GB/T 1.12009 给出的规则起草。 本部分由
4、中华人民共和国海关总署提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国郑州海关、中华人民共和国成都海关、中华人民共和国拱北 海关、中华人民共和国合肥海关、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国北京海关、中华人民共 和国大连海关、中华人民共和国厦门海关、杭州众测生物科技有限公司。 本部分主要起草人：苗丽、林华、罗宝正、陈静、宗凯、王娉、汪琳、郑秋月、徐淑菲、孔繁 德、程奇。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 1 SN/T 5227.102019 出口食品中貂源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法） 1 范围 SN/T 52272019 的本部分规定了出口食品中貂源性成分的 R
5、AA 检测方法。 本部分适用于出口食品中貂源性成分的定性检测。 2 规范性引用文件 本部分所规定方法的最低检出限（LOD）为 0.1 %（W/W）。 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 274032008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语、定义和缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 貂 Martes 食肉目，裂脚亚目，鼬科，鼬亚科，貂属。常见的有以下几种：美洲貂、黄喉
6、貂（青鼬）、石貂 （榉貂）、松貂（林貂）、日本貂、渔貂、紫貂（黑貂）。我国产石貂、紫貂、渔貂、黄喉貂四种。 3.1.2 实时荧光 RAA real-time RAA 一种重组酶介导链替换的恒温核酸快速扩增技术（简称 RAA 技术）。利用从细菌或真菌中获得的 重组酶，在恒温下（一般为 37 42 ），该重组酶可与引物紧密结合，形成酶和引物的聚合体，在 单链 DNA 结合蛋白的帮助下，打开模板 DNA 的双链结构，当引物在模板 DNA 上搜索到与之完全匹 配的互补序列时，在 DNA 聚合酶的作用下，形成新的 DNA 互补链，扩增产物以指数级增长。利用荧 光探针的标记，随着 RAA 反应的进行，RA
7、A 产物与荧光信号的增长呈现对应关系。 3.1.3 Ct 值 cycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。 3.1.4 T 值 time threshold 每个反应管内荧光信号达到设定阈值时所需要的时间。 以正式出版文本为准 2 SN/T 5227.102019 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BS-recA ：枯草芽孢杆菌重组酶（ Bacillus subtilis recombinase）。 Bsu ：枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis）。 CTAB ：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammonium brom
8、ide）。 DNA ：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleic acid）。 dNTPs ：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonuleoside triphosphate）。 EDTA ：乙二胺四乙酸（ethylene diaminetetraacetic acid）。 RAA ：重组酶介导扩增（recombinase-aid amplification）。 SC-recA ：天蓝色链霉菌重组酶（ Streptomyces coelicolor recombinase）。 SSB ：单链 DNA 结合蛋白（single stranded DNA binding protein）。 Tric
9、ine ：N- 三羟甲基甲基氨基酸（N-tris Hydroxymethyl methylglycine）。 Tris ：三羟甲基氨基甲烷 tris（Hydroxymethyl）aminomethane。 4 方法提要 以提取的 DNA 为模板，采用貂的特异性检测引物和探针进行实时荧光 RAA 扩增，根据实时荧光 RAA 的增幅情况，实现对食品和饲料中貂成分的检测鉴定。 5 试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合 GB/T 6682 的要求。所有试剂均 用无 DNA 酶污染的容器分装。 表 1 检测用引物和探针 物种名称 引物 / 探针序列（5 3 ） 扩增片段长
10、度 靶基因 貂 F ：ATTCTCACCTGACCTGTTAGGAGACCCAGAC 269bp 线粒体细胞色素 b 基因（Cytb） R ：TAAGGAGATCAGCTACTAGTAATCAGAACAAGC P ：ACTTCCTATTCGCATATGCTATCCTA CGAFAM-dTCTHFABQH-dTCCCTAATAAACTAG-C3spacer 注： 目的基因序列参见附录 A。F 为上游引物，R 为下游引物，P 为探针，FAM-dT，THF，BQH-dT 和 C3spacer 均为探针修饰基团。 5.1 CTAB 提取缓冲液（pH8.0）：10 g/L CTAB，0.7 mol/L
11、NaCl，0.05 mol/L Tris-HCl，0.01 mol/L Na 2 EDTA。 5.2 酚 ： 氯仿 ： 异戊醇 =25 ： 24 ： 1。 5.3 异丙醇。 5.4 70% 乙醇（体积比）。 5.5 TE 缓冲液（pH8.0）：10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1 mmol/L EDTA（pH8.0）。 以正式出版文本为准 3 SN/T 5227.102019 5.6 缓冲液 A ：20 % 聚乙二醇。 5.7 实时荧光 RAA 扩增体系：2.5 mmol/L dNTPs，225 ng/ L SSB，300 ng/ L recA 重组酶蛋白（SC- recA/
12、BS-recA），75 ng/ L Bsu DNA 聚合酶，75 ng/ L Exo 核酸外切酶，250 mmol/L Tricine，12.5 mmol/ L 二硫苏糖醇，250 ng/ L 肌酸激酶。也可以使用等效的商品化的试剂盒代替。 5.8 缓冲液 B ：280 mol/L 醋酸镁。 6 仪器设备 6.1实时荧光 PCR 仪。 6.2恒温荧光检测仪。 6.3核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 6.4恒温水浴锅。 6.5离心机：转速大于等于 12 000 r/min。 6.6微量移液器：量程 0.5 L10 L，10 L100 L，20 L200 L，200 L1000 L。 6.7研钵及
13、粉碎装置。 6.8涡旋振荡器。 6.9离心管：2mL、1.5mL。 7 检测步骤 7.1 DNA 提取 取 0.2 g 粉碎或磨碎的样品至一洁净的 1.5 mL 离心管中（6.9）（若样品含杂质和调味品，可加入 1 mLdd H 2 O 洗涤两次），加入 600 L CTAB 提取缓冲液（pH 8.0）（5.1），涡旋振荡混匀后于 70 温 育 15 min，期间颠倒离心管 23 次； 12 000 r/min 离心 5 min，取上清液于一新的干净 1.5 mL 离心管中； 加入 500 L 酚 ： 氯仿 ： 异戊醇（25 ： 24 ： 1）（5.2），上下颠倒离心管 23 次后涡旋振荡混匀
14、，12 000 r/min 离心 5 min ；转移上层水相至一新的 1.5 mL 离心管中，加入 0.7 倍体积异丙醇（5.3），上下颠倒 离心管 23 次，4 静置 30 min，4 下 12 000 r/min 离心 3 min，小心弃去上清液；加入 700 L 70 % 乙醇（5.4），重悬沉淀，12 000 r/min 离心 1 min，小心弃去上清液；打开管盖，室温挥发干液体， 加入 50 L100 L TE 缓冲液（pH8.0）（5.5）溶解 DNA，-20 保存备用。DNA 提取也可采用等效 DNA 提取试剂盒进行。 7.2 DNA 浓度和纯度的测定 使用核酸蛋白分析仪或紫外分
15、光光度计分别检测 260 nm 和 280 nm 处的吸光值 A 260 和A 280 。DNA 的浓度按照式（1）计算： c=A N50/1000 （1） 式中： c DNA 浓度，单位为微克每微升（ g/L ）； A260 nm 处的吸光值； N核酸稀释倍数。 当 A 260 /A 280 比值在 1.71.9 之间时，适宜于 RAA 扩增。 以正式出版文本为准 4 SN/T 5227.102019 7.3 实时荧光 RAA 扩增 7.3.1 实时荧光 RAA 反应总体系 见表 2。 表 2 实时荧光 RAA 反应总体系 试剂 体积 / L 实时荧光 RAA 扩增体系（5.7） 20 缓冲
16、液 A（5.6） 12.5 正向引物 (10 mol/L) 2.0 反向引物 (10 mol/L) 2.0 探针 (10 mol/L) 0.6 DNA 模板（5 ng/ L） 2.0 缓冲液 B（5.8） 2.5 加 ddH 2 O至 50 7.3.2 实时荧光 RAA 反应程序 7.3.2.1 实时荧光 PCR 仪 39 ，60 s，1 个循环；39 ，30 s，40 个循环，在每次循环时收集荧光。 7.3.2.2 恒温荧光检测仪 39 ，1 min ；39 ，20 min，第二阶段开始收集荧光。 7.3.3 实验对照 检测过程中分别设阳性对照、阴性对照、空白对照。采用含有貂源成分的样品作为
17、阳性对照样 品，不含貂源成分的样品作为阴性对照样品，以与模板等体积的双蒸水作为空白对照样品。 8 质量控制 8.1 实时荧光 PCR 仪 8.1.1 空白对照：无荧光对数增长，相应的无报告 Ct 值。 8.1.2 阴性对照：无荧光对数增长，相应的无报告 Ct 值。 8.1.3 阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的 Ct 值小于等于 30.0。 8.2 恒温荧光检测仪 8.2.1 空白对照：无荧光对数增长，相应的无报告 T 值（时间）。 8.2.2 阴性对照：无荧光对数增长，相应的无报告 T 值（时间）。 8.2.3 阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲
18、线，相应的 T 值（时间）小于等于 15 min。 以正式出版文本为准 5 SN/T 5227.102019 9 结果判断与表述 9.1结果判定 9.1.1 实时荧光 PCR 仪 9.1.1.1 在符合条款 8.1 的情况下，结果才能判为有效。 9.1.1.2 如 Ct 值小于等于 35.0，则判定被检样品阳性。 9.1.1.3 如 Ct 值大于 35.0 小于 40.0，则重复一次。如再次检测结果仍然是 Ct 值大于 35.0 小于 40.0， 则判定被检样品阳性。 9.1.1.4 如无报告 Ct 值或无荧光对数增长则判定被检样品阴性。 9.1.2 恒温荧光检测仪 9.1.2.1 在符合条款
19、 8.2 的情况下，结果才能判为有效。 9.1.2.2 如 T 值（时间）小于等于 15 min，则判定被检样品阳性。 9.1.2.3 如 T 值（时间）大于 15min 小于 20 min，则重复一次。如再次检测结果仍然是 T 值（时间） 大于 15min 小于 20 min，则判定被检样品阳性。 9.1.2.4 如无报告 T 值（时间）或无荧光对数增长则判定被检样品阴性。 9.2 结果表述 9.2.1 样品阳性，表述为“检出貂成分”。 9.2.2 样品阴性，表述为“未检出貂成分”。 10 检测过程中防止交叉污染的措施 检测过程中防止交叉污染的措施按照 GB/T 274032008 中附录
20、D 的规定执行。 以正式出版文本为准 6 SN/T 5227.102019 附 录 A （资料性附录） 貂源性成分的基因扩增靶标参考序列 ATTCTCACCTGACCTGTTAGGAGACCCAGAC AATTATATTCCTGCTAACCCACTCAACACACCTCCC CATATCAAACCTGAATGGT ACTTCCTATTCGCATATGCTATCCTACGATCCATCCCTAATAAACTAG GAG GAGTACTTGCCTTAGTTTTTTCTATTCTAGTTCTAGCTATCATTCCCCTACTGCACACCTCAAAACAACGAA GCATGATATTCCGCCC
21、ACTAAGCCAGT GCTTGTTCTGATTACTAGTAGCTGATCTCCTTA 注：加方框部分为引物结合区域，阴影部分为探针结合区域。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 SN / T 5227.102019 SN/T 5227.10 2019 中华人民共和国出入境检验检疫 开本 8801230 1/16 印张 0.75 字数 14 千字 2020 年 1 月第一版 2020 年 1 月第一次印刷 印数 1500 书号：15517591 定价 16.00 元 出口食品中貂源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法） 行 业 标 准 SN/T 5227.102019 * * * 北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023） 编辑部：（010）65194242-7509 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 中国海关出版社有限公司出版发行 网址
