1、以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5227.7 2019 出口食品中马源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法） Rapid detection of horse derived ingredient in food for export Recombinase-aid amplification （RAA） method 2019-12-27发布 2020-07-01 实施 ICS 67.050 C 53 中华人民共和国海关总署发 布 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 SN/T 5227.7 2019 I 前 言 SN/T 522720
2、19出口食品中动物源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增（RAA）法 预计分为如下部分： 第 1 部分：出口食品中鸡源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）； 第 2 部分：出口食品中猪源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）； 第 3 部分：出口食品中羊源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）； 第 4 部分：出口食品中鸭源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）； 第 5 部分：出口食品中牛源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）； 第 6 部分：出口食品中水牛源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸
3、扩增法（RAA 法）； 第 7 部分：出口食品中马源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）； 第 8 部分：出口食品中驴源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）； 第 9 部分：出口食品中狐狸源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）； 第 10 部分：出口食品中貂源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）； 第 11 部分：出口食品中大鼠源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）。 本部分为 SN/T 52272019 第 7 部分。 本部分按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。 本部分由中华人民共
4、和国海关总署提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国郑州海关、中华人民共和国厦门海关、郑州牧业经济学院、 中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国北京海关、中华人民共和国大连海关、中华人民共和国成 都海关、中华人民共和国石家庄海关、杭州众测生物科技有限公司。 本部分主要起草人：苗丽、徐淑菲、王海花、张秀平、韩建勋、汪琳、郑秋月、林华、孔繁德、 王建昌、程奇。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 SN/T 5227.7 2019 1 出口食品中马源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法） 1 范围 SN/T 52272019 的本部分规定了出口食品中马源性成分的 RAA 检
5、测方法。 本部分适用于出口食品中马源性成分的定性检测。 2 规范性引用文件 此部分所规定方法的最低检出限（LOD）为 0.1 %（W/W）。 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 274032008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语、定义和缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 马 Equus caballus 奇蹄目，马形亚目，马科，马亚科，马属。 3.1.2 实时荧光
6、 RAA real-time RAA 一种重组酶介导链替换的恒温核酸快速扩增技术（简称 RAA 技术）。利用从细菌或真菌中获得的 重组酶，在恒温下（一般为 37 42 ），该重组酶可与引物紧密结合，形成酶和引物的聚合体，在 单链 DNA 结合蛋白的帮助下，打开模板 DNA 的双链结构，当引物在模板 DNA 上搜索到与之完全匹 配的互补序列时，在 DNA 聚合酶的作用下，形成新的 DNA 互补链，扩增产物以指数级增长。利用荧 光探针的标记，随着 RAA 反应的进行，RAA 产物与荧光信号的增长呈现对应关系。 3.1.3 Ct 值 cycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定阈值
7、时所经历的循环数。 3.1.4 T 值 Time threshold 每个反应管内荧光信号达到设定阈值时所需要的时间。 以正式出版文本为准 SN/T 5227.7 2019 2 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BS-recA ： Bacillus subtilis recombinase，枯草芽孢杆菌重组酶。 Bsu ： Bacillus subtilis，枯草芽孢杆菌。 CTAB ：cetyltrithylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵。 DNA ：deoxyribonuleic acid，脱氧核糖核酸。 dNTPs ：deoxyribonuleoside t
8、riphosphate，脱氧核苷三磷酸。 EDTA ：ethylene diaminetetraacetic acid，乙二胺四乙酸。 RAA ：重组酶介导扩增（recombinase-aid amplification）。 SC-recA ： Streptomyces coelicolor recombinase，天蓝色链霉菌重组酶。 SSB ：single stranded DNA binding protein，单链 DNA 结合蛋白。 Tricine ：N-tris Hydroxymethyl methylglycine，N- 三羟甲基甲基氨基酸。 Tris ：tris（Hydroxy
9、methyl）aminomethane，三羟甲基氨基甲烷。 4 方法提要 以提取的 DNA 为模板，采用马的特异性检测引物和探针进行实时荧光 RAA 扩增，根据实时荧光 RAA 的增幅情况，实现对食品和饲料中马成分的检测鉴定。 5 试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合 GB/T 6682 的要求。所有试剂均 用无 DNA 酶污染的容器分装。 表 1 检测用引物和探针 物种名称 引物 / 探针序列（5 null 3 null） 扩增片段长度 靶基因 马 F ：AGCTATTCCCCTATGGGCAGGGACAGTATT 211bp 线粒体 ATP 合成酶 6 （A
10、TPase-6） R ：GATGAGGTGTATTAGGAGGTGTCCGGCGGT P ：TACTAGTAATTATCGAGACTATCAGCC TATFAM-dTTTHFBHQ-dTTCAACCTGTAGCCCT-C3spacer 注： 目的基因序列参见附录 A。F 为上游引物，R 为下游引物，P 为探针，FAM-dT，THF，BQH-dT 和 C3spacer 均为探针修饰基团。 5.1 CTAB 提取缓冲液（pH8.0）：10 g/L CTAB，0.7 mol/L NaCl，0.05 mol/L Tris-HCl，0.01 mol/L Na 2 EDTA。 5.2 酚 ： 氯仿 ： 异
11、戊醇 =25 ： 24 ： 1。 5.3 异丙醇。 5.4 70% 乙醇（体积比）。 5.5 TE 缓冲液（pH8.0）：10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1 mmol/L EDTA（pH8.0）。 5.6 缓冲液 A ：20 % 聚乙二醇。 以正式出版文本为准 SN/T 5227.7 2019 3 5.7 实时荧光 RAA 扩增体系：2.5 mmol/L dNTPs，225 ng/ nullL SSB，300 ng/ nullL recA 重组酶蛋白（SC- recA/BS-recA），75 ng/ nullL Bsu DNA 聚合酶，75 ng/ nullL Exo 核酸
12、外切酶，250 mmol/L Tricine，12.5 mmol/ L 二硫苏糖醇，250 ng/ nullL 肌酸激酶。也可以使用等效的商品化的试剂盒代替。 5.8 缓冲液 B ：280 mol/L 醋酸镁。 6 仪器设备 6.1 实时荧光 PCR 仪。 6.2 恒温荧光检测仪。 6.3 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 6.4 恒温水浴锅。 6.5 离心机：转速大于等于 12 000 r/min。 6.6 微量移液器：量程 0.5 nullL10 nullL，10 nullL100 nullL，20 nullL200 nullL，200 nullL1 000 nullL。 6.7 研钵及粉
13、碎装置。 6.8 涡旋振荡器。 6.9 离心管：2 mL、1.5 mL。 7 检测步骤 7.1 DNA 提取 取 0.2 g 粉碎或磨碎的样品至一洁净的 1.5 mL 离心管（6.9）中（若样品含杂质和调味品，可加入 1 mLdd H 2 O 洗涤两次），加入 600 nullL CTAB 提取缓冲液（pH8.0）（5.1），涡旋振荡混匀后于 70 温 育 15 min，期间颠倒离心管 2 次 3 次； 12 000 r/min 离心 5 min，取上清液于一新的干净 1.5 mL 离心 管中；加入 500 nullL 酚 ： 氯仿 ： 异戊醇（25 ： 24 ： 1）（5.2），上下颠倒离心
14、管 23 次后涡旋振荡混匀， 12 000 r/min 离心 5 min ；转移上层水相至一新的 1.5 mL 离心管中，加入 0.7 倍体积异丙醇（5.3），上 下颠倒离心管 23 次，4 静置 30 min，4 下 12 000 r/min 离心 3 min，小心弃去上清液；加入 700 nullL 70 % 乙醇（5.4），重悬沉淀，12 000 r/min 离心 1 min，小心弃去上清液；打开管盖，室温挥发干 液体，加入 50 nullL 100 nullL TE 缓冲液（pH8.0）（5.5）溶解 DNA，-20 保存备用。 7.2 DNA 浓度和纯度的测定 使用核酸蛋白分析仪或紫
15、外分光光度计分别检测 260 nm 和 280 nm 处的吸光值 A 260 和A 280 。DNA 的浓度按照式（1）计算： c=A N50/1000 （1） 式中： cDNA 浓度，单位为微克每微升（ g/L ）； A260 nm 处的吸光值； N核酸稀释倍数。 当 A 260 /A 280 比值在 1.71.9 之间时，适宜于 RAA 扩增。 以正式出版文本为准 SN/T 5227.7 2019 4 7.3 实时荧光 RAA 扩增 7.3.1 实时荧光 RAA 反应总体系 见表 2。 表 2 实时荧光 RAA 反应总体系 试剂 体积 / nullL 实时荧光 RAA 扩增体系（5.7）
16、20 缓冲液 A（5.6） 12.5 正向引物（10 null mol/L） 2.0 反向引物（10 null mol/L） 2.0 探针（10 null mol/L） 0.6 DNA 模板（5 ng/ nullL) 2.0 缓冲液 B（5.8） 2.5 加 ddH 2 O至 50 7.3.2 实时荧光 RAA 反应程序 7.3.2.1 实时荧光 PCR 仪 39 ，60 s，1 个循环；39 ，30 s，40 个循环，在每次循环时收集荧光。 7.3.2.2 恒温荧光检测仪 39 ，1 min ；39 ，20 min，第二阶段开始收集荧光。 7.3.3 实验对照 检测过程中分别设阳性对照、阴性
17、对照、空白对照。采用含有马源成分的样品作为阳性对照样 品，不含马源成分的样品作为阴性对照样品，以与模板等体积的双蒸水作为空白对照样品。 8 质量控制 8.1 实时荧光 PCR 仪 8.1.1 空白对照：无荧光对数增长，相应的无报告 Ct 值。 8.1.2 阴性对照：无荧光对数增长，相应的无报告 Ct 值。 8.1.3 阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的 Ct 值小于等于 30.0。 8.2 恒温荧光检测仪 8.2.1 空白对照：无荧光对数增长，相应的无报告 T 值（时间）。 8.2.2 阴性对照：无荧光对数增长，相应的无报告 T 值（时间）。 8.2.3 阳性对照：
18、有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的 T 值（时间）小于等于 15 min。 以正式出版文本为准 SN/T 5227.7 2019 5 9 结果判断与表述 9.1结果判定 9.1.1 实时荧光 PCR 仪 9.1.1.1 在符合条款 8.1 的情况下，结果才能判为有效。 9.1.1.2 如 Ct 值小于等于 35.0，则判定被检样品阳性。 9.1.1.3 如大于 35.0 小于 40.0，则重复一次。如再次检测结果仍然是大于 35.0 小于 40.0，则判定被 检样品阳性。 9.1.1.4 如无报告 Ct 值或无荧光对数增长则判定被检样品阴性。 9.1.2 恒温荧光检测仪 9.
19、1.2.1 在符合条款 8.2 的情况下，结果才能判为有效。 9.1.2.2 如 T 值（时间）小于等于 15min，则判定被检样品阳性。 9.1.2.3 如大于 15min 小于 20min，则重复一次。如再次检测结果仍然是大于 15min 小于 20min，则 判定被检样品阳性。 9.1.2.4 如无报告 T 值（时间）或无荧光对数增长则判定被检样品阴性。 9.2 结果表述 9.2.1 样品阳性，表述为“检出马成分”。 9.2.2 样品阴性，表述为“未检出马成分”。 10 检测过程中防止交叉污染的措施 检测过程中防止交叉污染的措施按照 GB/T 274032008 中附录 D 的规定执行。
20、 以正式出版文本为准 SN/T 5227.7 2019 6 附 录 A （资料性附录） 马源性成分的基因扩增靶标参考序列 AGCTATTCCCCTATGGGCAGGGACAGTATT CATAGGCTTTCGTCACAAAACAAAAGC AGCCCTAGCCCACTTTCTACCTCAAGGGACGCCCATTTTCCTCATCCCCA TACTAGTAATTA TCGAGACTATCAGCCTATTTATTCAACCTGTAGCCCT AGCCGTGCGGCTAACCGCTAACATT ACCGCCGGACACCTCCTAATACACCTCATC 注：加方框部分为引物结合区域，阴影部分为探
21、针结合区域。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 SN/T 5227.72019 SN/T 5227.7 2019 中华人民共和国出入境检验检疫 开本 8801230 1/16 印张 0.75 字数 14 千字 2020 年 1 月第一版 2020 年 1 月第一次印刷 印数 1500 书号：15517592 定价 16.00 元 出口食品中马源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法） 行 业 标 准 SN/T 5227.72019 * * * 北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023） 编辑部：（010）65194242-7509 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 中国海关出版社有限公司出版发行 网址
