SN T 5227.4-2019 出口食品中鸭源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA法).pdf

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资源描述

1、以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5227.4 2019 出口食品中鸭源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法) Rapid detection of duck derived ingredient in food for export Real-time recombinase-aid amplification (RAA) method 2019-12-27发布 2020-07-01 实施 ICS 67.050 C 53 中华人民共和国海关总署发 布 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 SN/T 5227.4 2019 I 前 言 SN

2、/T 52272019出口食品中动物源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法)分为 11 个部分: 第 1 部分:出口食品中鸡源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法); 第 2 部分:出口食品中猪源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法); 第 3 部分:出口食品中羊源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法); 第 4 部分:出口食品中鸭源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法); 第 5 部分:出口食品中牛源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法); 第 6 部分:出口食品中水牛源性成分快速检测

3、 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法); 第 7 部分:出口食品中马源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法); 第 8 部分:出口食品中驴源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法); 第 9 部分:出口食品中狐狸源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法); 第 10 部分:出口食品中貂源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法); 第 11 部分:出口食品中大鼠源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法)。 本部分为 SN/T 52272019 的第 4 部分。 本部分按照 GB/T 1.12009 的规则进行编

4、写。 本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本部分起草单位:中华人民共和国郑州海关、中华人民共和国北京海关、中国检验检疫科学研 究院、中国动物卫生与流行病学中心、中华人民共和国厦门海关、中华人民共和国拱北海关、中华人 民共和国大连海关、中华人民共和国杭州海关、中华人民共和国福州海关。 本部分主要起草人:苗丽、汪琳、乔晴、邓婷婷、李阳、张九凯、徐淑菲、罗宝正、郑秋月、 吴姗、孔繁德、郑晶。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 1 SN/T 5227.4 2019 出口食品中鸭源性成分快速检测 重组酶介导链置换核酸扩增法(RAA 法) 1 范围 本部分规定了出口食品中鸭源性成分的 RAA

5、 检测方法。 本部分适用于出口食品中鸭源性成分的定性检测。此标准所规定方法的最低检出限(LOD)为 0.01%(W/W)。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 274032008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语、定义和缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 鸭 Anatinae 雁形目,鸭科,鸭亚科,鸭族,鸭属,常说的鸭是鸭亚科水禽的统称,也称真

6、鸭。分为潜水鸭, 钻水鸭和栖鸭。 3.1.2 实时荧光 RAA real-time RAA 一种重组酶介导链替换的恒温核酸快速扩增技术(简称 RAA 技术)。利用从细菌或真菌中获得的 重组酶,在恒温下(一般为 37 42 ),该重组酶可与引物紧密结合,形成酶和引物的聚合体,在单 链 DNA 结合蛋白的帮助下,打开模板 DNA 的双链结构,当引物在模板 DNA 上搜索到与之完全匹配 的互补序列时,在 DNA 聚合酶的作用下,形成新的 DNA 互补链,扩增产物以指数级增长。利用荧光 探针的标记,随着 RAA 反应的进行,RAA 产物与荧光信号的增长呈现对应关系。 3.1.3 Ct 值 cycle

7、threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。 3.1.4 T 值 Time threshold 每个反应管内荧光信号达到设定阈值时所需要的时间。 以正式出版文本为准 2 SN/T 5227.4 2019 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 3.2.1RAA :recombinase-aid amplification,重组酶介导扩增。 3.2.2DNA :deoxyribonuleic acid,脱氧核糖核酸。 3.2.3CTAB :cetyltrithylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵。 3.2.4Tris :tris(Hydroxym

8、ethyl)aminomethane,三羟甲基氨基甲烷。 3.2.5EDTA :ethylene diaminetetraacetic acid,乙二胺四乙酸。 3.2.6dNTPs :deoxyribonuleoside triphosphate,脱氧核苷三磷酸。 3.2.7SSB :single stranded DNA binding protein,单链 DNA 结合蛋白。 3.2.8SC-recA : Streptomyces coelicolor recombinase,天蓝色链霉菌重组酶。 3.2.9BS-recA : Bacillus subtilis recombinase,

9、枯草芽孢杆菌重组酶。 3.2.10 Bsu : Bacillus subtilis,枯草芽孢杆菌。 3.2.11Tricine :N-tris Hydroxymethyl methylglycine,N- 三羟甲基甲基氨基酸。 4 方法提要 以提取的 DNA 为模板,采用鸭的特异性检测引物和探针进行实时荧光 RAA 扩增,根据实时荧光 RAA 的增幅情况,实现对食品和饲料中鸭成分的检测鉴定。 5 试剂和材料 除另有规定外,所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合 GB/T 6682 的要求。所有试剂均 用无 DNA 酶污染的容器分装。 表 1 检测用引物和探针 物种名称 引物 / 探针序列(

10、5 null 3 null) 扩增片段长度 靶基因 鸭 F :TCGCAGGAATCACCCTAGTCCACTTAACCTTC 253bp 线粒体细胞色素 b 基因(Cytb) R :TATCATTCTGGTTTAATGTGTGGTGGGGTTAC P :TGTGACAAAATCCCATTCCACCCCTACTTCFAM-dTCTHF BHQ-dTTTAAGGACATCCTAGG-C3spacer 注: 目的基因序列见附录 A。F 为上游引物,R 为下游引物,P 为探针,FAM-dT,THF,BQH-dT 和 C3spacer 均为探针修饰基团。 5.1 CTAB 提取缓冲液(pH8.0):1

11、0 g/L CTAB,0.7 mol/L NaCl,0.05 mol/L Tris-HCl,0.01 mol/L Na 2 EDTA。 5.2 酚 : 氯仿 : 异戊醇 =25 : 24 : 1。 5.3 异丙醇。 5.4 70% 乙醇(V/V)。 5.5 TE 缓冲液(pH8.0):10 mmol/L Tris-HCl(pH8.0),1mmol/L EDTA(pH8.0)。 以正式出版文本为准 3 SN/T 5227.4 2019 5.6 A Buffer(缓冲液 A):20% 聚乙二醇。 5.7 实时荧光 RAA 扩增体系:2.5 mmol/L dNTPs,225 ng/ L SSB,30

12、0 ng/ L recA 重组酶蛋白(SC- recA/BS-recA),75 ng/ L Bsu DNA 聚合酶,75 ng/ L Exo 核酸外切酶,250 mmol/L Tricine,12.5 mmol/ L 二硫苏糖醇,250 ng/ L 肌酸激酶。也可以使用等效的商品化的试剂盒代替。 5.8 B Buffer(缓冲液 B):280 mM 醋酸镁。 6 仪器设备 6.1 实时荧光 PCR 仪。 6.2 恒温荧光检测仪。 6.3 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 6.4 恒温水浴锅。 6.5 离心机:转速 12 000 r/min。 6.6 微量移液器:量程 0.5 L10 L,10

13、L100 L,20 L200 L,200 L1 000 L。 6.7 研钵及粉碎装置。 6.8 涡旋震荡器。 6.9 离心管:2 mL、1.5 mL。 7 检测步骤 7.1 DNA 提取 取 0.2g 粉碎或磨碎的样品至一洁净的 1.5 mL 离心管中(若样品含杂质和调味品,可加入 1 mLdd H 2 O 洗涤两次),加入 600 L CTAB 提取缓冲液,涡旋震荡混匀后于 70 温育 15 min,期间颠倒离 心管2次3 次; 12 000 r/min 离心 5 min,取上清于一新的干净 1.5 mL 离心管中;加入 500 L 酚 : 氯 仿 : 异戊醇(25 : 24 : 1),上下

14、颠倒离心管 2 次 3 次后涡旋震荡混匀,12 000 r/min 离心 5 min ;转 移上层水相至一新的 1.5 mL 离心管中,加入 0.7 倍体积异丙醇,上下颠倒离心管 2 次 3 次,4 静 置 30 min,4 下 12 000 r/min 离心 3 min,小心弃去上清液;加入 700 L 70 % 乙醇,重悬沉淀,12 000 r/min 离心 1 min,小心弃去上清液;打开管盖,室温挥发干液体,加入 50 L 100 L TE(pH8.0) 缓冲液溶解 DNA,-20 保存备用。 DNA 提取也可采用等效 DNA 提取试剂盒进行。 7.2 DNA 浓度和纯度的测定 使用核

15、酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测 260 nm 和 280 nm 处的吸光值 A 260 和A 280 。DNA 的浓度按照公式(1)计算: c=A N50/1000 (1) 公式中: c=DNA 浓度,单位为微克每微升( g/L ); A=260nm 处的吸光值; N= 核酸稀释倍数。 当 A 260 /A 280 比值在 1.71.9 之间时,适宜于 RAA 扩增。 以正式出版文本为准 4 SN/T 5227.4 2019 7.3 实时荧光 RAA 扩增 7.3.1 实时荧光 RAA 反应总体系 表 2 实时荧光 RAA 反应总体系 试剂 体积 / nullL 实时荧光 RAA 扩增体

16、系 20 nullL A Buffer 12.5 nullL 正向引物 (10 nullM) 2.0 nullL 反向引物 (10 nullM) 2.0 nullL 探针 (10 nullM) 0.6 nullL DNA 模板 (5 ng/ nullL) 2.0 nullL B Buffer 2.5 nullL 加 ddH 2 O至 50 nullL 7.3.2 实时荧光 RAA 反应程序 可选用以下两种扩增仪器之一进行检测,反应程序对应如下。 7.3.3 实时荧光 PCR 仪 39 ,60 s,1 个循环;39 ,30 s,40 个循环,在每次循环时收集荧光。 7.3.4 恒温荧光检测仪 3

17、9 ,1 min ;39 ,20 min,第二阶段开始收集荧光。 7.3.5 实验对照 检测过程中分别设阳性对照、阴性对照、空白对照。采用含有鸭源成分的样品作为阳性对照样 品,不含鸭源成分的样品作为阴性对照,以与模板等体积的双蒸水作为空白对照。 8 质量控制 8.1 实时荧光 PCR 仪 8.1.1 空白对照:无荧光对数增长,相应的无报告 Ct 值。 8.1.2 阴性对照:无荧光对数增长,相应的无报告 Ct 值。 8.1.3 阳性对照:有荧光对数增长,且荧光通道出现典型的扩增曲线,相应的 Ct 值 30.0。 8.2 恒温荧光检测仪 8.2.1 空白对照:无荧光对数增长,相应的无报告 T 值(

18、时间)。 8.2.2 阴性对照:无荧光对数增长,相应的无报告 T 值(时间)。 8.2.3 阳性对照:有荧光对数增长,且荧光通道出现典型的扩增曲线,相应的 T 值(时间) 15min。 以正式出版文本为准 5 SN/T 5227.4 2019 9 结果判断与表述 9.1结果判定 9.1.1 实时荧光 PCR 仪 9.1.1.1 在符合条款 8.1 的情况下,结果才能判为有效。 9.1.1.2 如 Ct 值 35.0,则判定被检样品阳性。 9.1.1.3 如 35.0 Ct 值 40.0,则重复一次。如再次检测结果仍然是 35.0 Ct 值 40.0,则判定 为被检样品阳性。 9.1.1.4 如

19、无报告 Ct 值或无荧光对数增长则判定被检样品阴性。 9.1.2 恒温荧光检测仪 9.1.2.1 在符合条款 8.2 的情况下,结果才能判为有效。 9.1.2.2 如 T 值(时间) 15min,则判定被检样品阳性。 9.1.2.3 如 15min T 值(时间) 20min,则重复一次。如再次检测结果仍然是 15min T 值(时 间) 20min,则判定为被检样品阳性。 9.1.2.4 如无报告 T 值(时间)或无荧光对数增长则判定被检样品阴性。 9.2结果表述 9.2.1 样品阳性,表述为“检出鸭成分”。 9.2.2 样品阴性,表述为“未检出鸭成分”。 10 检测过程中防止交叉污染的措施

20、 检测过程中防止交叉污染的措施按照 GB/T 274032008 中附录 D 的规定执行。 以正式出版文本为准 6 SN/T 5227.4 2019 附 录 A (资料性附录) 鸭源性成分的基因扩增靶标参考序列 TCGCAGGAATCACCCTAGTCCACTTAACCTTC CTACACGAATCAGGCTCAAACAACCCCCTAGGTCT TGTATCAGAC TGTGACAAAATCCCATTCCACCCCTACTTCTCCTTTAAGGACATCCTAGG ATTTATCCTCA TGCTTACCCCCCTCATAGCACTAGCCCTATTCTCACCTAACCTTCTAGGGG

21、ACCCAGAAAACTTCACCCCC GCAAACCCCCTA GTAACCCCACCACACATTAAACCAGAATGATA 注:加方框部分为引物结合区域,阴影部分为探针结合区域。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 SN / T 5227.42019 SN/T 5227.4 2019 中华人民共和国出入境检验检疫 开本 8801230 1/16 印张 0.75 字数 24 千字 2020 年 月第一版 2020 年 月第一次印刷 印数 1500 书号: 1551752 定价 16.00 元 出口食品中鸭源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法) 行 业 标 准 SN/T 5227.42019 * * * 北京市朝阳区东四环南路甲 1 号(100023) 编辑部:(010)65194242-7509 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 中国海关出版社有限公司出版发行 网址

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