SN T 5227.8-2019 出口食品中驴源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA法).pdf

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资源描述

1、以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5227.8 2019 出口食品中驴源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法) Rapid detection of donkey derived ingredient in food for export Recombinase-aid amplification (RAA) method 2019-12-27发布 2020-07-01 实施 ICS 67.050 C 53 中华人民共和国海关总署发 布 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 SN/T 5227.8 2019 I 前 言 SN/T 52272

2、019出口食品中动物源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法)预计分为如下部分: 第 1 部分:出口食品中鸡源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法); 第 2 部分:出口食品中猪源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法); 第 3 部分:出口食品中羊源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法); 第 4 部分:出口食品中鸭源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法); 第 5 部分:出口食品中牛源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法); 第 6 部分:出口食品中水牛源性成分快速检测 重组酶介导链替换

3、核酸扩增法(RAA 法); 第 7 部分:出口食品中马源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法); 第 8 部分:出口食品中驴源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法); 第 9 部分:出口食品中狐狸源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法); 第 10 部分:出口食品中貂源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法); 第 11 部分:出口食品中大鼠源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法)。 本部分为 SN/T 52272019 第 8 部分。 本部分按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。 本部分由中华人

4、民共和国海关总署提出并归口。 本部分起草单位:中华人民共和国郑州海关、中国检验检疫科学研究院、中国动物卫生与流行 病学中心、浙江省食品药品检验研究院、中华人民共和国大连海关、中华人民共和国厦门海关、中华 人民共和国北京海关、中华人民共和国拱北海关、中华人民共和国杭州海关、中华人民共和国福州海 关、杭州众测生物科技有限公司。 本部分主要起草人:苗丽、邓婷婷、高洁、李阳、沈泓、郑秋月、徐淑菲、汪琳、罗宝正、吴 姗、郑晶、程奇。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 1 SN/T 5227.8 2019 出口食品中驴源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法) 1 范围 SN/T 5

5、2272019 的本部分规定了出口食品中驴源性成分的 RAA 检测方法。 本部分适用于出口食品中驴源性成分的定性检测。 2 规范性引用文件 本部分所规定方法的最低检出限(LOD)为 0.1 %(W/W)。 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 274032008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语、定义和缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 驴 Equus asinus

6、奇蹄目,马形亚目,马科,马亚科,马属,与马同属于马属。 3.1.2 实时荧光 RAA real- time RAA 一种重组酶介导链替换的恒温核酸快速扩增技术(简称 RAA 技术)。利用从细菌或真菌中获得的 重组酶,在恒温下(一般为 37 42 ),该重组酶可与引物紧密结合,形成酶和引物的聚合体,在 单链 DNA 结合蛋白的帮助下,打开模板 DNA 的双链结构,当引物在模板 DNA 上搜索到与之完全匹 配的互补序列时,在 DNA 聚合酶的作用下,形成新的 DNA 互补链,扩增产物以指数级增长。利用荧 光探针的标记,随着 RAA 反应的进行,RAA 产物与荧光信号的增长呈现对应关系。 3.2缩略

7、语 下列缩略语适用于本文件。 BS-recA : Bacillus subtilis recombinase,枯草芽孢杆菌重组酶。 Bsu : Bacillus subtilis,枯草芽孢杆菌。 CTAB :cetyltrithylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵。 DNA :deoxyribonuleic acid,脱氧核糖核酸。 以正式出版文本为准 2 SN/T 5227.8 2019 dNTPs :deoxyribonuleoside triphosphate,脱氧核苷三磷酸。 EDTA :ethylene diaminetetraacetic acid,乙二胺四乙

8、酸。 RAA :重组酶介导扩增(recombinase-aid amplification)。 SC-recA : Streptomyces coelicolor recombinase,天蓝色链霉菌重组酶。 SSB :single stranded DNA binding protein,单链 DNA 结合蛋白。 Tricine :N-tris Hydroxymethyl methylglycine,N- 三羟甲基甲基氨基酸。 Tris :tris(Hydroxymethyl)aminomethane,三羟甲基氨基甲烷。 4 方法提要 以提取的 DNA 为模板,采用驴的特异性检测引物和探针进

9、行实时荧光 RAA 扩增,根据实时荧光 RAA 的增幅情况,实现对食品和饲料中驴成分的检测鉴定。 5 试剂和材料 除另有规定外,所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合 GB/T 6682 的要求。所有试剂均 用无 DNA 酶污染的容器分装。 表 1 检测用引物和探针 物种名称 引物 / 探针序列(5 3 ) 扩增片段长度 靶基因 驴 F :ATCGTCCATCTACTATTCCTCCACGAAACA 146bp 线粒体细胞色素 b 基因(Cytb) R :AGGGTTAGTAGGAGTAGGACTAGGAGGAGA P :ATCTGACATAGACAAAATCCCATTCCAC CCGFA

10、M-dTATHFBHQ-dTACACAATTAAAGACA-C3spacer 注: 目的基因序列参见附录 A。F 为上游引物,R 为下游引物,P 为探针,FAM-dT,THF,BQH-dT 和 C3spacer 均为探针修饰基团。 5.1 CTAB 提 取 缓 冲 液(pH8.0):10 g/L CTAB,0.7 mol/L NaCl,0.05 mol/L Tris-HCl,0.01 mol/L Na 2 EDTA。 5.2 酚 : 氯仿 : 异戊醇 =25 : 24 : 1。 5.3 异丙醇。 5.4 70% 乙醇(体积比)。 5.5 TE 缓冲液(pH8.0):10 mmol/L Tris

11、-HCl(pH8.0),1 mmol/L EDTA(pH8.0)。 5.6 缓冲液 A :20% 聚乙二醇。 5.7 实时荧光 RAA 扩增体系:2.5 mmol/L dNTPs,225 ng/ L SSB,300 ng/ L recA 重组酶蛋白(SC- recA/BS-recA),75 ng/ L Bsu DNA 聚合酶,75 ng/ L Exo 核酸外切酶,250 mmol/L Tricine,12.5 mmol/ L 二硫苏糖醇,250 ng/ L 肌酸激酶。也可以使用等效的商品化的试剂盒代替。 5.8 缓冲液 B :280 mol/L 醋酸镁。 6 仪器设备 6.1 实时荧光 PCR

12、 仪。 以正式出版文本为准 3 SN/T 5227.8 2019 6.2 恒温荧光检测仪。 6.3 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 6.4 恒温水浴锅。 6.5 离心机:转速 12 000 r/min。 6.6 微量移液器:量程 0.5 L10 L,10 L100 L,20 L200 L,200 L1 000 L。 6.7 研钵及粉碎装置。 6.8 涡旋振荡器。 6.9 离心管:2 mL、1.5 mL。 7 检测步骤 7.1 DNA 提取 取 0.2 g 粉碎或磨碎的样品至一洁净的 1.5mL 离心管(6.9)中(若样品含杂质和调味品,可加入 1 mLdd H 2 O 洗涤两次),加入 60

13、0 L CTAB 提取缓冲液(pH8.0)(5.1),涡旋振荡混匀后于 70 温 育 15 min,期间颠倒离心管 2 次 3 次; 12 000 r/min 离心 5 min,取上清液于一新的干净 1.5 mL 离心 管中;加入 500 L 酚 : 氯仿 : 异戊醇(25 : 24 : 1)(5.2),上下颠倒离心管 2 次 3 次后涡旋振荡 混匀,12 000 r/min离心5 min;转移上层水相至一新的1.5 mL离心管中,加入0.7倍体积异丙醇(5.3), 上下颠倒离心管 2 3 次,4 静置 30 min,4 下 12 000 r/min 离心 3 min,小心弃去上清液;加入 7

14、00 L 70 % 乙醇(5.4),重悬沉淀,1 2000 r/min 离心 1 min,小心弃去上清液;打开管盖,室温挥发 干液体,加入 50 L 100 L TE 缓冲液(pH8.0)(5.5)溶解 DNA,-20 保存备用。DNA 提取也可 采用等效 DNA 提取试剂盒进行。 7.2 DNA 浓度和纯度的测定 使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测 260 nm 和 280 nm 处的吸光值 A 260 和A 280 。DNA 的浓度按照式(1)计算: c=A N50/1000 (1) 式中: c DNA 浓度,单位为微克每微升( g/L ); A260 nm 处的吸光值; N核酸稀

15、释倍数。 当 A 260 /A 280 比值在 1.71.9 之间时,适宜于 RAA 扩增。 7.3 实时荧光 RAA 扩增 7.3.1 实时荧光 RAA 反应总体系 见表 2。 以正式出版文本为准 4 SN/T 5227.8 2019 表 2 实时荧光 RAA 反应总体系 试剂 体积 / L 实时荧光 RAA 扩增体系(5.7) 20 缓冲液 A (5.6) 12.5 正向引物 (10 mol/L) 2.0 反向引物 (10 mol/L) 2.0 探针 (10 mol/L) 0.6 DNA 模板 (5 ng/ L) 2.0 缓冲液 B(5.8) 2.5 加 ddH 2 O至 50 7.3.2

16、 实时荧光 RAA 反应程序 7.3.2.1 实时荧光 PCR 仪 39 ,60 s,1 个循环;39 ,30 s,40 个循环,在每次循环时收集荧光。 7.3.2.2 恒温荧光检测仪 39 ,1 min ;39 ,20 min,第二阶段开始收集荧光。 7.3.3 实验对照 检测过程中分别设阳性对照、阴性对照、空白对照。采用含有驴源成分的样品作为阳性对照样 品,不含驴源成分的样品作为阴性对照样品,以与模板等体积的双蒸水作为空白对照样品。 8 质量控制 8.1 实时荧光 PCR 仪 8.1.1 空白对照:无荧光对数增长,相应的无报告 Ct 值。 8.1.2 阴性对照:无荧光对数增长,相应的无报告

17、 Ct 值。 8.1.3 阳性对照:有荧光对数增长,且荧光通道出现典型的扩增曲线,相应的 Ct 值小于等于 30.0。 8.2 恒温荧光检测仪 8.2.1 空白对照:无荧光对数增长,相应的无报告 T 值(时间)。 8.2.2 阴性对照:无荧光对数增长,相应的无报告 T 值(时间)。 8.2.3 阳性对照:有荧光对数增长,且荧光通道出现典型的扩增曲线,相应的 T 值(时间)小于等于 15 min。 以正式出版文本为准 5 SN/T 5227.8 2019 9 结果判断与表述 9.1结果判定 9.1.1 实时荧光 PCR 仪 9.1.1.1 在符合条款 8.1 的情况下,结果才能判为有效。 9.1

18、.1.2 如 Ct 值小于等于 35.0,则判定被检样品阳性。 9.1.1.3 如 Ct 值大于 35.0 小于 40.0,则重复一次。如再次检测结果仍然是大于 35.0 小于 40.0,则判 定被检样品阳性。 9.1.1.4 如无报告 Ct 值或无荧光对数增长则判定被检样品阴性。 9.1.2 恒温荧光检测仪 9.1.2.1 在符合条款 8.2 的情况下,结果才能判为有效。 9.1.2.2 如 T 值(时间)小于等于 15 min,则判定被检样品阳性。 9.1.2.3 如大于 15 min 小于 20 min,则重复一次。如再次检测结果仍然是大于 15 min 小于 20 min, 则判定被检

19、样品阳性。 9.1.2.4 如无报告 T 值(时间)或无荧光对数增长则判定被检样品阴性。 9.2 结果表述 9.2.1 样品阳性,表述为“检出驴成分”。 9.2.2 样品阴性,表述为“未检出驴成分”。 10 检测过程中防止交叉污染的措施 检测过程中防止交叉污染的措施按照 GB/T 274032008 中附录 D 的规定执行。 以正式出版文本为准 6 SN/T 5227.8 2019 附 录 A (资料性附录) 驴源性成分的基因扩增靶标参考序列 ATCGTCCATCTACTATTCCTCCACGAAACA GGATCCAACAACCCCTCAGGAATCCC ATCTGACATAGACAAAAT

20、C CCATTCCACCCGTACTACACAATTAAAGACA TCCTAGGACT TCTCCTCCTAGTCCTACTCCTACTAACCCT 注:加方框部分为引物结合区域,阴影部分为探针结合区域。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 SN/T 5227.82019 SN/T 5227.8 2019 中华人民共和国出入境检验检疫 开本 8801230 1/16 印张 0.75 字数 14 千字 2020 年 1 月第一版 2020 年 1 月第一次印刷 印数 1500 书号:15517590 定价 16.00 元 出口食品中驴源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA 法) 行 业 标 准 SN/T 5227.82019 * * * 北京市朝阳区东四环南路甲 1 号(100023) 编辑部:(010)65194242-7509 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 中国海关出版社有限公司出版发行 网址

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