1、ICS 65.150 B 52 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 36372020 水产品中氧氟沙星、 诺氟沙星残留量的测定 胶体金免疫层析法 Determination of residues of ofloxacin and nofloxacinmetabolites in aquatic ProductsColloidal gold immunochromatography method 文稿版次选择 2020 - 06 - 22 发布 2020 - 07 - 22 实施 安徽省市场监督管理局 发布 DB34/T 36372020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-200
2、9 给出的规则起草。 本标准由安徽省水产技术推广总站提出。 本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：安徽名湖农业科技有限公司、宁国市金东坊农业开发有限公司、合肥金荣生态农 业有限公司、安徽省水产技术推广总站、安徽国泰众信检测技术有限公司、宁国市金鼎家庭农场、合肥 市畜牧水产技术推广中心、安徽省农产品质量安全检测中心、杭州南开日新生物技术有限公司、宣城市 阿太特种水产养殖有限公司。 本标准主要起草人：孙德祥、蒋军、卞红正、许世富、桂淦、李瑞、何广、周作友、陈洪周、徐丽、 荣朝振、钱之云、吴敏、沈亚东、王婷、郭恒心、金家红、刘卫芳、魏泽能、桑丽雅、王振、何超、范 希芹、王先锋、杨
3、忠喜、凌建海、彭克平、秦道仓、彭文广。 DB34/T 36372020 1 水产品中氧氟沙星、诺氟沙星残留量的测 定 胶体金免疫层析法 1 范围 本标准规定了水产品中氧氟沙星（ofloxacin，缩写 Ofl）、诺氟沙星（norfloxacin，缩写 Nor） 残留量的测定 胶体金免疫层析法的的原理、试剂和材料、仪器与设备、分析步骤、结果判断、性能指 标及阳性结果确证。 本标准适用于鱼类、虾类等水产品中氧氟沙星、诺氟沙星残留量的快速筛检，本方法氧氟沙星、诺 氟沙星的检出限均为 2.0 g/kg。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适
4、用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 30891 水产品抽样规范 农业部 1077号公告-1-20 08 水产品中17种磺胺类及15种喹 诺酮类药物残留量的测定 液相色谱- 串联质谱法 农业部 1192号公告-1-2009 水产苗种违禁药物抽检技术规范 3 原理 本法应用竞争抑制免疫层析原理。样品溶液中的氧氟沙星、诺氟沙星与胶体金标记的特异性单克隆 抗体结合，抑制了抗体和硝酸纤维素膜检测线上氧氟沙星、诺氟沙星-BSA 偶联物的结合。当样品中的 氧氟沙星、诺氟沙星含量超过本方法检出限时，检测
5、线（T 线）较控制线（C 线）浅甚至无显色，判定 为阳性；反之，当样品中的氧氟沙星、诺氟沙星含量在本方法检出限以下或无残留时，检测线显色与控 制线相近或偏深，判定为阴性。 4 试剂和材料 除特殊注明外，本法所用试剂均为分析纯，用水应符合 GB/T 6682 规定的二级水。 4.1 浓盐酸，浓度大于 37。 4.2 磷酸氢二钠。 4.3 磷酸二氢钾。 4.4 氯化钠。 4.5 氯化钾。 4.6 乙酸乙酯：色谱纯 4.7 正己烷：色谱纯 4.8 甲醇：色谱纯 DB34/T 36372020 2 4.9 吐温-20。 4.10 1 mol/L 盐酸溶液：量取 8.6 mL 浓盐酸（4.1），加蒸馏水
6、定容至 100 mL，室温保存。 4.11 0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（含 0.5吐温-20，pH 7. 4）：溶解 8.0 g 氯化钠（4.4）、0.2 g 氯 化钾（4.5）、1.44 g 磷酸氢二钠（4.2）、0.24 g 磷酸二氢钾 （4.3）、0.5 mL 吐温-20（4.9）于 800 mL 水中溶解，并用水定容至 1000 mL，用盐酸溶液（4.10）调 pH 至 7.4，经 121高压灭菌 15 min，4 下避光保存。 4.12 标准溶液的配制 4.12.1 氧氟沙星、 诺氟沙星标准储备液 （100 mg/L） ： 分别准确称取 10 mg氧氟沙星 （CAS： 8241
7、9-36-1） 、 诺氟沙星（CAS：70458-96-7），用甲醇溶解，定容至 100 mL，-18冰箱中保存，有效期 6 个月。 4.12.2 氧氟沙星、诺氟沙星标准中间液（1 mg/L）：分别准确移取标准储备液 1 mL 于100 mL 容量瓶 中，用甲醇定容至刻度。4冷藏避光保存，有效期 1 个月。 4.13 氟喹诺酮类药物胶体金免疫层析快速检测试剂板组成，参见附录 A。 5 仪器与设备 5.1 电子天平：感量 0.01 g、0.0001 g。 5.2 均质机：转速不小于 8 000 r/min。 5.3 离心机：转速不小于 4 000 r/min。 5.4 氮吹仪：加热温度不小于 6
8、0 。 5.5 移液枪：1 L10 L，10 L100 L，100 L1 000 L。 5.6 高压灭菌锅。 6 分析步骤 6.1 试样制备 6.1.1 鱼洗净后去鳞，取皮及肌肉部分；虾去头、壳、肠腺，取肌肉部分，剪碎，用均质机均质，-18 保存，试样量不少于 50 g。 6.1.2 试样制备应按 GB/T 30891 或农业部1192 号公告-1-2009 的规定执行。 6.2 提取 称取 2 g 0.1 g 均质后样品于 5 mL 离心管中，加入 3 mL 乙酸乙酯（4.6），剧烈振荡 3 min， 室温（ 20 5）下 4000 r/min 离心 5 min；移取 2 mL 上清液于另一
9、 5 mL 试管中， 60下吹近 干；向试管中依次加入 0.3 mL 正己烷 （4.7）和 0.3 mL 磷酸盐缓冲液（4.11），充分混匀。静置 2 min， 待检。 6.3 测定 6.3.1 所有操作需在室温下（205）进行。 6.3.2 取出氟喹诺酮类胶体金免疫层析检测试剂板， 吸取 6.2 中待测液 100 L于加样孔中， 在 3 min 5 min 内读取结果。 6.4 质控试验 6.4.1 空白对照：以磷酸盐缓冲液（4.11）代替 6.2中待测液按 6.3 进行测定。 DB34/T 36372020 3 6.4.2 质控样测定：每一批次测定时，须选取已知不含氧氟沙星、诺氟沙星的均质
10、水产品组织作为质 控样，称取两份平行样，其中一份作为阴性质控样，另一份添加氧氟沙星、诺氟沙星标准溶液使其终浓 度均为 2 g/kg，作为阳性质控样。按 6.2 和6.3 步骤进行。 注： 不同制造商间的胶体金免疫层析检测试剂板产品组成和操作会有细微的差别，应严格按说明书要求规范操作。 7 结果判断 7.1 检测结果 7.1.1 无效与有效 空白对照结果控制线（C 线）不出现红色条带，说明检测试剂板失效，不能进行检测（见图1，分 图a）；如空白对照结果控制线（C 线）和检测线（T 线）均出现红色条带，而且 T 线比 C 线颜色深 或一样深，说明检测试剂板有效，可进行检测。 7.1.2 阴性结果
11、待测试验检测线（T 线）出现红色条带，且颜色比控制线（C 线）深或一样深（见图1，分图b）为 阴性。 7.1.3 阳性结果 待测试样检测线（T 线）出现红色条带，但颜色比控制线（C 线）浅或检测线（T 线）未出现红色 条带（见图1，分图c）为阳性。 a） b） c） 图1 结果判断图 注： 检验结果需注明检出限。 7.2 质量控制要求 7.2.1 每批次样品检测时，或胶体金卡批号不同时，均需按 6.4进行质控。 7.2.2 阴性质控样结果应为阴性；阳性质控样结果应为阳性，否则试验无效。 8 性能指标 DB34/T 36372020 4 8.1 检出限：氧氟沙星检出限为 2.0 g/kg、诺氟沙
12、星检出限为 2.0 g/kg。 8.2 灵敏度：灵敏度应99。 8.3 特异性：特异性应95。 8.4 假阳性率：假阳性率应5。 8.5 假阴性率：假阴性率应1。 8.6 性能指标计算方法见附录 B。 9 阳性结果确证 试样中氧氟沙星、诺氟沙星检测结果为阳性时，应用农业部 1077号公告-1-2008 的方法或等价方 法确证。 DB34/T 36372020 5 A A 附 录 A （资料性附录） 氟喹诺酮类药物胶体金免疫层析快速检测试剂板组成 酮类胶体金免疫层析快速检测试剂板组成（见图A.1，含分图a、b） a）试剂板剖视图 b）试剂板俯视图 图中： 1 塑料模板； 2 加样孔； 3 观察窗
13、； 4 背衬； 5 样品垫； 6 胶体金标记结合垫； 7 NC膜； 8 检测线（T）； 9 控制线（C）； 10 吸水垫； 11 不干胶。 图A.1 样品垫：玻璃纤维或纸质薄片。 胶体金标记结合垫：聚酯纤维片，胶体释放时间小于 5 min，释放效率大于 80。 NC膜：孔径为 12 m，4 cm 毛细管时间小于 135 s。 吸水垫：滤纸或玻璃纤维或吸水纸。 背衬：PVC。 塑料模板：内置试纸条卡槽。 DB34/T 36372020 6 B B 附 录 B （规范性附录） 性能指标计算方法 表B.1 定性方法性能计算表 样品情况 检测结果 总数 阳性 阴性 阳性 N11 N12 N1.=N11+N12 阴性 N21 N22 N2.=N12+N22 特异性（p-，） p-=N22/N2. 灵敏度(p+，) p+=N11/N1. 假阴性率（pf-，） pf-=N12/N1. 假阳性率（pf+，） pf+=N22/N2. 注1： 样品情况是由基准方法检验得到的结果；检测结果是由本方法得到的检测结果。 注2： N指任何特定单元的结果数，第一个下标指行，第二个下标指列。 例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N2.表示所有的第二行；N12表示第一行，第二列。 _
