1、 ICS 13.310 CCS A 92 中 华 人 民 共 和 国 公 共 安 全 行 业 标 准 GA GA/T 法庭科学 生物检材 中 扎 来普隆 、 脱乙基 扎来普隆 和 5-氧 -扎来普隆 检验 液相色谱 -质谱法 Forensic sciences Examination methods for zaleplon, deethylzaleplon and 5-oxy-zaleplon in biological samples LC-MS -发布 - -实施 中华人民共和国公安部 发 布 GA/T I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 2020标准化工作导则 第 1 部分：标准
2、化文件的结构和起草规则的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件 由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技术委员会（ SAC/TC 179/SC 1）提出并归口。 本文件 起草单位：公安部物证鉴定中心 、中国 政法 大学 、山西医科大学 、德州市物证鉴定研究中心 。 本文件 主要 起草人： 王爱华、 张蕾萍、 徐多麒 、 王瑞花、 任昕昕、 邹波、孙会会、 宋歌、董林沛、 贠克明、王玉瑾 。 GA/T 1 法庭科学 生物检材中扎来普隆、脱乙基扎来普隆和 5-氧 -扎来普 隆检验 液相色谱 -质谱 法 1 范围 本 文件 规定了 法庭科
3、学 领域 生物检材（ 血液、尿液 ） 中 扎来普隆 及 其代谢物脱乙基扎来普隆、 5-氧 -扎来普隆 的液相色谱 -质谱（ LC-MS） 定性定量分析 方法。 本 文件 适用于 法庭科学 领域 生物检材（ 血 液 、尿 液 ） 中 扎来普隆 和 脱乙基扎来普隆、 5-氧 -扎来普隆 的定性定量分析。 其他 检材 可参照使用。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件 。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T
4、122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本文件。 4 原理 以空白样品和添加样品 作对照，按平行操作的要求， 对生物 检材 进行 提取、净化及浓缩， 采 用 液相 色谱 -质谱 法 检测 ， 以保留时间、质谱特征离子 对 和 离子 对 丰度比 作为定性判断依据；以峰面积为依据， 采用外标法 进行定量分析。 5 试剂和材料 5.1 试剂 实验用水应符合 GB/T 6682 中规定的一级水。除非另有说明，在分析中使用的试剂均为色谱纯 ， 试剂包括： a) 甲醇； b) 乙腈 ； c) 甲酸； d) 碳 酸盐缓冲液（ pH值 10）： 称 取 碳 酸钠 （分
5、析纯） 2.962g，加水溶解并 稀释 至 100mL；称取 碳 酸 氢钠 （分析纯） 0.840g，加水溶解并 稀释 至 100mL。将配好的碳酸钠和碳酸氢钠溶液按 6:4体 积比 混合配制成 pH值 10缓冲液 ； e) 0.1%甲酸 水 溶液 ： 移取 0.5mL 甲酸 ， 用水 稀释 至 500mL； f) 0.1%甲酸乙腈 溶液 ：移取 0.5mL甲酸 ， 用乙腈稀释至 500mL； GA/T 2 g) 20%甲醇水溶液（含氨水 0.5%）：移取 0.5mL氨水，加入 20mL甲醇，并用水 稀释 至 100mL； h) 标准 溶 液： 1) 1.0mg/mL 标准物质储备液 ：根据
6、扎来普隆 、 脱乙基扎来普隆 、 5-氧 -扎来普隆 标准物质 的纯度， 各 称取适量， 分别 用甲醇 配制 1.0mg/mL 扎来普隆、 脱乙基扎来普隆、 5-氧 -扎 来普隆 标准物质 储备液，密封 ， -18以下保存，有 效期 6 个月。或采用市售标准溶液； 2) 0.1mg/mL 单一标准物质工作溶液：移取 1.0mg/mL 标准物质储备溶液， 分别 用甲醇配制 成浓度为 0.1mg/mL 的单一标准工作溶液，密封， 04保存，有效期 6 个月。实验中 所用其他浓度的单一标准工作溶液均由 1.0mg/mL 标准物质储备溶液配制得到； 3) 0.1mg/mL 混合标准物质工作溶液：分别移
7、取 1.0mg/mL 的 扎来普隆、脱乙基扎来普隆、 5- 氧 -扎来普隆 标准物质储备溶液，用甲醇配制成浓度为 0.1mg/mL 的混合标准物质工作溶 液，密封， 04保存，有效期 6 个月。实验中所用其他浓度的混合标准物质工作溶液 均由 1.0mg/mL 标准物质储备液配制得到 。 5.2 材料 材料包括： a) 固相萃取柱： Oasis HLB柱或等效固相萃取柱； 注 ： Oasis HLB柱是 Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示 对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品 。 b) 具盖离心管； c) 具塞玻璃试管
8、； d) 有机 系 微孔滤膜： 0.22m。 6 仪器和设备 仪器和设备包括 ： a) 液相色谱 -串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ ESI）和 三重四极杆质量分析器 ； b) 电子天平 ：实际分度值 d0.01mg； c) 离心机； d) 振荡器； e) 浓缩器； f) 移液器。 7 操作方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品前处理 7.1.1.1 蛋白沉淀 移 取血液或尿液 检材 样品 1.0mL， 于具盖离心管中， 依次加入 pH 值 10 的 碳酸盐缓冲液 0.2mL 和 乙腈 3.0mL， 振荡 10min， 不低于 8000r/min 离心 10min 以上，分离有机相，经有机 系
9、 微孔滤膜过滤， 作为检材样品提取液，供仪器检测。 注： 检材样品取样量 、缓冲液体积 和乙腈体积可根据实际情况调整。 7.1.1.2 固相萃取 GA/T 3 移取血液或尿液检材样品 1.0mL，于具盖离心管中， 加入 pH 值 10 的 磷酸缓冲液 4mL，振荡 10min， 8000r/min 离心 10min 以上，取上清液转移至已活化好的固相萃取柱中 （ 使用前依次用甲醇 3mL、水 3mL 进行活化 ） ，控制上清液过柱流速为 1mL/min，用 20%甲醇水溶液（含氨水 0.5%） 3mL 淋洗，挤干水 分或离心或真空抽固相萃取柱 2min，用 0.1%甲酸 乙腈 溶液 3mL 洗
10、脱，控制流速为 0.5mL/min1.0mL/min， 收集洗脱液，经有机微孔滤膜过滤，作为检材样品提取液，供仪器检测；或将洗脱液置于浓缩 器上 50 浓缩至干，残留物用 甲醇 0.2mL 溶解， 经有机微孔滤膜过滤， 作为检材样品提取液，供仪器检测。 注 ： 检材样品取样量、缓冲液体积 、洗脱溶剂体积 及定容体积可根据实际情况调整。 7.1.1.3 质控 样品制备 取等量相似基质的空白样品两份于具盖离心管中，一份作为空白样品，一份添加 单一或混合 标准物 质 工作溶液 ， 使 扎来普隆、脱乙基扎来普隆、 5-氧 -扎来普隆 浓度为 30ng/mL， 作为添加样品 ， 与检材样 品平行操作，
11、得到空白样品提取液和添加样品提取液 ， 供仪器 检测 。 7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 液相色谱 -串联质谱仪条件 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整： a) 色谱柱： ZORBAX Eclipse Plus C18（ 2.1 mm150mm,1.8m） 或等效色谱柱； 注： ZORBAX Eclipse Plus C18 为 Agilent 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并 不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 柱温： 40； c) 流动相： A 相 ： 0.1%甲酸水 溶液 ；
12、B 相： 0.1%甲酸乙腈 溶液 ； d) 流速： 0.4mL/min； e) 洗脱：梯度洗脱，梯度洗脱条件见表 1； 表 1 流动相和梯度洗脱条件 时间 min 流动相 A 流动相 B 0.1 90% 10% 0.5 90% 10% 0.51 50% 50% 1.6 50% 50% 1.7 90% 10% 4.0 90% 10% f) 扫描方式：正离子扫描 （ ESI+） ； g) 检测方式：多反应监测 （ MRM） ； h) 电喷雾电压： 5500 V； i) 离子源温度： 600； j) 雾化气压力： 55psi； k) 气帘气压力： 30psi； l) 辅助气压力： 50psi； m)
13、 定性、定量离子对和去簇电压、碰撞能量条件见表 2。 GA/T 4 表 2 定性、定量离子对和锥孔电压、碰撞能量条件 目标物 定量离子对 m/z 定性离子对 m/z 去簇电压 V 碰撞能量 eV 扎来普隆 306.1/236.0 306.1/236.0 140 36 306.1/264.0 140 28 脱乙基扎来普隆 278.2/260.2 278.2/260.2 90 26 278.2/236.0 90 32 5-氧 -扎来普隆 322.2/280.2 322.2/280.2 140 22 322.2/252.2 140 35 7.1.2.2 进样 分别吸取 空白溶剂、添加样品提取液、 空
14、白样品提取液、 检材样品提取液 、 标准 物质 工作溶液，按 7.1.2.1仪器条件进样分析。 进样顺序和进样次数应确保结果有效。 7.2 定量分析 7.2.1 样品前处理 移取血液或尿液检材样品 1.0mL两份，按 7.1.1进行操作 得到检材 样品提取液供仪器检测 。 用 外标 -单点校正 法定量时， 取与检材样品等量的相似基质空白样品 三 份， 其中一份作为空白样品， 另外两份 添加扎来普隆、脱乙基扎来普隆、 5-氧 -扎来普隆标准物质作为添加样品，与检材样品平行操 作，得到 空白样品 提取液 和 添加样品提取液供仪器检测。 检材 样品中目标物含量应 在 添加 样品中目标物 含量的（ 1
15、0050） %范围内 。 用 外标 -校准 曲线法定量时 ， 取与检材样品等量的相似基质空白样品 七份 ， 其中一份作为空白样品， 另外六份 添加不同浓度的 扎来普隆、脱乙基扎来普隆、 5-氧 -扎来普隆 标准物质（添加浓度应呈良好的线 性关系，且检材样品中目标物的含量应在线性范围内），作为添加样品，与检材样品平行操作，得到添 加样品提取液，供仪器检 测 。 7.2.2 仪器检测 7.2.2.1 仪器条件 同 7.1.2.1。 7.2.2.2 进样 分别吸取检材样品提取液、空白样品提取液、添加样品提取液 ，按 7.1.2.1 仪器条件 进样分析。每 份检材样品提取液和添加样品提取液各 进样分析
16、 2 3 次 。 7.2.3 计算 7.2.3.1 计算含量 7.2.3.1.1 外标 -单点校正法 记录检材样品提取液和添加样品提取液中目标物的保留时间和峰面积值，按公式（ 1）计算检材样 品中目标物的 含量 。 = . . （ 1） GA/T 5 式中： 检材样品中目标物的含量； A 检材样品 提取液 中目标物的峰面积 的平均值 ； A 添加样品 提取液 中目标物的峰面积 的平均值 ； 添加样品中目标物的 含量 。 7.2.3.1.2 外标 -校 准曲线法 记录检材样品提取液和添加样品提取液中目标物的保留时间和峰面积值，以 添加样品提取液中 目 标物的峰面积 的平均值为纵坐标、 添加样品提
17、取液中 目标物的含量为横坐标进行线性回归，得到线性方 程。根据检材样品提取液中目标物的峰面积值，按公式 （ 2） 计算出检材样品中目标物的 含量 。 = . （ 2） 式中： 检材样品中目标物的含量 ; y 检材样品提取液中目标物的峰面积的平均值； a 线性方程的斜率 ； b 线性方程的截距 。 7.2.3.2 计算相对相差 记录 7.2.3.1 中计算得到的检材样品中目标物的含量， 按公式 （ 3） 计算相对相差： 12 100%-RD = . （ 3） 式中： RD 相对相差，用百分比（ %）表示； 1、 2 两份检材样品中目标物的含量； 两份检材样品中目标物含量的平均值。 8 结果评价
18、8.1 定性结果评价 8.1.1 阳性结果评价 在相同条件下进行样品测定时， 检材 样品中目标物的色谱峰保留时间与 标准物质工作溶液 一致（相 对偏差在 2.5%之内）、目 标物的两对定 性离子与 标准物质工作溶液 一致，且离子 对 丰度比与浓度接近的 标准物质工作溶液 相比，相对偏差不超过表 3 规定的范围，空白样品无干扰，则可判断检材样品中检出 目标物。 表 3 离子对丰度比的最大允许 相对 偏差范围 离子对丰度比 50% 20% 50% 10% 20% 10% 最大允许相对偏差 20% 25% 30% 50% 8.1.2 阴性结果评价 检材样品未出现与目标物标准 物质工作 溶液一致的色谱
19、峰，且添加样品中出现与目标物标准 物质 X GA/T 6 工作 溶液一致的色谱峰，空白样品无干扰，则可判断检材样品中未检出目标物。 8.2 定 量 结果评价 检材样品中 目标物含量的 RD 20%，定量数据可靠，其含量按 两 份检材的平均值计算。检材样品中 目标物含量的 RD 20%，定量数据不可靠 ， 应按 7.2重新提取检验。 相关实验数据及谱图 参见附录 A。 GA/T 7 附 录 A （资料性） 相关资料 、 谱图 及检出限 A.1 扎来普隆 、 脱乙基扎来普隆、 5-氧 -扎来普隆 的相关资料 扎来普隆 一般口服给药，治疗 剂 量 10mg 20mg， 吸收迅速，血浆蛋白结合率低 ，
20、为亲脂性化合物。 最初分布在肝、肾、胃肠道、肾上腺和胰腺，然后迅速分布在所有组织。经 CYP3A4 酶代谢，转化为 非活性的 脱 乙基及 5-氧 -扎来普隆 代谢产物，有极少部分（不到 0.1%）以原药形式从尿排出。 扎来普隆、 脱乙基扎来普隆、 5-氧 -扎来普隆 的分子式、分子量见表 A.1。 表 A.1 扎来普隆 、 脱乙基扎来普隆 和 5-氧 -扎来普隆 的 分子式 和 分子量 名称 扎来普隆 脱乙基扎来普隆 5-氧 -扎来普隆 分子式 C17H15N5O C15H11N5O C17H15N5O2 分子量 305.34 277.28 321.33 A.2 扎来普隆 、 脱乙基扎来普隆
21、、 5-氧 -扎来普隆 的相关谱图 扎来普隆、脱乙基扎来普隆、 5-氧 -扎来普隆的相关谱图 见图 A.1图 A.3。 图 A.1 扎来普隆 LC-MS/MS 谱图 图 A.2 脱乙基扎来普隆 LC-MS/MS 谱图 GA/T 8 图 A.3 5-氧 -扎来普隆 LC-MS/MS 谱图 A.3 扎来普隆 、 脱乙基扎来普隆 、 5-氧 -扎来普隆 的 检出限 血液 中 扎来普隆、脱乙基扎来普隆、 5-氧 -扎来普隆 检出限 见表 A.2。 表 A.2 血液中扎来普隆、脱乙基扎来普隆、 5-氧 -扎来普隆 的检出限 目标物 检出限（蛋白沉淀法） ng/mL 检出限（固相萃取法） ng/mL 扎来普隆 2 0.5 脱乙基扎来普隆 2 1 5-氧 -扎来普隆 5 1 A _
