1、以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5177 2021 中华人民共和国海关总署发 布 ICS 11. 020 CCS C 62 2021-06-18 发布 2022-01-01 实施 国境口岸寨卡病毒实时荧光 RT-PCR 检测方法 Real-time RT-PCR method for detecting Zika Virus at frontier ports 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 I SN/T 5177 2021 前 言 本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则第一部分：标准化文件的结构和起草规则的规 定起草。 本文件由中华人民
2、共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院、杭州富集生物科技有限公司。 本文件主要起草人：刘丽娟、王静、张晓龙、慈颖、马爱敏、曹晓梅、杨宇、张丽萍、胡孔新。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 1 SN/T 5177 2021 国境口岸寨卡病毒实时荧光 RT-PCR 检测方法 1范围 本文件规定了国境口岸寨卡病毒实时荧光 RT-PCR 检测方法的生物安全要求，样本的采集、运 输、寨卡病毒实时荧光 RT-PCR 检测方法和现场快速检测方法。 本文件适用于国境口岸入出境人员疑似寨卡病毒的核酸检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不
3、可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）租 用于本文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 WS/T 230 临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用 人间传染的病原微生物名录（中华人民共和国卫生部卫科教发200615 号） 可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定（中华人民共和国卫生部令第 45 号） 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1寨卡病毒 Zika virus 一种黄病毒科黄病毒属病毒，呈球形，直径约为 40 nm70 nm，有包膜。基因组为单股正链 RNA，
4、长度为 10.8 Kb，分为亚洲型和非洲型。寨卡病毒抵抗力不详，但黄病毒属病毒一般不耐酸、不耐热， 60 30 min 可灭活，70乙醇、0.5次氯酸钠、脂溶剂、过氧乙酸等消毒剂及紫外照射均可灭活。 3.2逆转录聚合酶链反应 reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR 将 RNA 的逆转录（RT）和 cDNA 的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。本标准采用一步法 逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）。在一步法RT-PCR中，首先以RNA为模板，利用下游特异性引物， 在依赖 RNA 的 DNA 聚合酶（逆转录酶）的作用下转录合
5、成互补 DNA（cDNA），该步骤称作“逆转录”； 随后，再以 cDNA 为模板，利用上游和下游特异性引物，在 DNA 聚合酶的作用下进行 PCR 循环扩增； 最终使 RNA 分子的某个特定区域（目的片段）被扩增达几百万倍。 3.3实时荧光 RT-PCR real-time fluorescence RT-PCR 在常规 RT-PCR 的基础上，加入一条特异性的荧光探针。该探针为一段寡聚核苷酸，两端分别 标记 1 个荧光报告基团和 1 个荧光淬灭基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收； PCR 扩增时，利用 Taq 酶的 5-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告基团和淬灭基团分离
6、，从而 荧光监测系统可以接收到荧光信号。 以正式出版文本为准 2 SN/T 5177 2021 3.4快速检测方法 Rapid detection method 不需样本前处理、核酸提取、纯化等步骤，采用商品化的通用型一步法核酸（RNA）检测试剂盒， 加入检测样本、寨卡病毒特异性引物和探针进行检测，实现将临床样本直接加到反应体系中进行实时 荧光 PCR 检测的全过程。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件： bp ：碱基对（base pair） Ct 值 : 每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数（Cycle threshold） DEPC ：焦碳酸乙二酯（diethyl pyroc
7、arbonate） FAM ：6- 羧基荧光素（6-carboxy-fluorescein） 5检测对象 5.1国境口岸发现的入出境人群中疑似寨卡病毒感染者。 5.2其他申请检验的人员。 6生物安全和 PCR 防污染要求 按照 GB 19489 和人间感染的病原微生物名录确定的要求，寨卡病毒相关材料的生物安全要 求如下： 寨卡病毒危害程度分类为第三类； 未经培养的寨卡病毒感染性材料的操作应该在生物安全二级（BSL-2）实验室内进行； 寨卡病毒相关的灭活材料和无感染性材料操作可在生物安全一级（BSL-1）实验室内进行； 寨卡病毒感染性材料运输和包装分为 B 类，UN 编号为 UN 3373 ；
8、PCR 防污染措施按照 WS/T 230 确定的规定执行。 7主要仪器 主要仪器设备如下： 荧光定量 PCR 仪，如 ABI 荧光定量 PCR 仪或卡尤迪 Mini8 Plus 实时荧光定量 PCR 仪 1） ； 高压灭菌器； 二级生物安全柜； -70 超低温冰箱（或液氮罐）； 台式高速低温离心机； 漩涡振荡器； 微量移液器。 1）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产 品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 以正式出版文本为准 3 SN/T 5177 2021 8主要试剂 主要试剂如下： DEPC 水； RNA 提取试剂盒：如 QIAa
9、mp Viral RNA kit 1） ； 一步法实时荧光 RT-PCR 试剂盒：如 Ag-Path-ID TM one step RT-PCR kit 1） ； 一步法核酸（RNA）检测试剂盒：如 Coyote 一步法核酸检测检测试剂盒 1） ； 引物和探针：序列见表 1。 表 1引物和探针序列 引物 / 探针名称 序列（5-3） 扩增片段 F CGCTAAGTTTGCATGCTCCAAGA 扩增片段为 124 bpR TCATGTCCTGTGTCATTAAC Probe FAM- ACCGGATAATGCTGTCAGTTCATGGCT -BHQ1 注： 探针 5端标记 FAM 荧光报告基团
10、，3标记 BHQ1 荧光淬灭基团。其他等效荧光标记物和淬灭基团或等效 的引物和探针或其他等效的商品化检测试剂盒也可使用。 9检验程序 9.1样本采集 9.1.1 唾液样本采集：先用清水漱口，静息 5 min10 min，弃去最初分泌物的唾液，将继续分泌的唾 液收集于洁净的容器内，至少 3 mL。若液量不足，可嘱其做口舌运动，促进分泌。 9.1.2 血液样本采集：用无菌真空干燥管，采集患者双份全血或 EDTA 抗凝血至少 5 mL，及时分离血 清或血浆，分装后保存于带螺旋盖、内有垫圈的冻存管内，标记清楚后低温保存，其中 1 管用于现场 实验室检测，1 管用于上级实验室复核检测。 9.1.3尿液样
11、本采集：以无菌容器收集受检者中段尿液待检 5 mL10 mL。 9.2实验室检验 9.2.1样本处理 9.2.1.1唾液样本前处理 采集的唾液样本经 4 000 r/min 离心 15 min 去沉淀，取上清液分装，每份 1 mL，用耐低温油性记 号笔记上编号，保存于带螺旋盖、内有垫圈的冻存管内后保存，备用。 9.2.1.2血液样本前处理 采集的血液样本，室温下自然放置 1 h2 h，待血液凝固、血块收缩，或用 1 500 r/min3 000 r/min 离心 15 min，吸出血清或血浆，分装后用耐低温油性记号笔记上编号，置于冻存管中备用。现场快速 检测时使用刚采集的全血即可检测。 1）由
12、指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产 品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 以正式出版文本为准 4 SN/T 5177 2021 9.2.1.3尿液样本的前处理 采集的尿液标本 2 000 r/min 离心 5 min 去沉淀，将上清液分装至无菌 15 mL 离心管中，每份 5 mL，用耐低温油性记号笔记上编号，置于合适的容器中备用。 9.2.2病毒核酸提取 参照商品化 RNA 核酸提取试剂盒说明书进行。 9.2.3实时荧光 RT-PCR 检测 9.2.3.1引物和探针 引物和探针应用液浓度配制成 10 mol/L，扩增片段大小 124
13、 bp。探针 5和 3端分别用 FAM 和 BHQ1 标记。 9.2.3.2阳性对照和空白对照设置 检测过程中分别设阳性对照和空白对照。阳性对照为寨卡病毒 RNA，空白对照用灭菌双蒸水。 9.2.3.3反应体系组成 表 2寨卡病毒实时荧光 RT-PCR 的反应体系 成分 体积 RNase-free ddH 2 O 4.5 L 2RT-PCR Buffer 12.5 L 10 mM Primer F 1 L 10 mM Primer R 1 L 10 mM probe 0.5 L Enzyme Mix 0.5 L 模板 RNA/ 阴性对照 / 阳性对照 5 L 注：寨卡病毒实时荧光 RT-PCR
14、 的反应总体系为 25 L。 9.2.3.4反应条件 一步法实时荧光 RT-PCR 反应条件：扩增条件为：45 10 min 1 次；95 10 min 1 次；95 15 s， 60 45 s，共 40 个循环。每个循环结束时采集荧光信号。选择 FAM 通道于 60退火时收集荧光信号； 设置 ROX 通道为参比通道。不同实验室可根据所使用的试剂和仪器参考上述反应条件作适当调整。 9.2.4检验结果判断及报告 9.2.4.1阈值确定 阈值确定的方法对所有的样本都是统一的，一般是以荧光 PCR 反应的前 315 个循环的荧光信 号作为荧光本底信号，以本底信号标准差的 10 倍作为荧光阈值，以样本
15、扩增产生的荧光信号达到荧 光阈值时所对应的循环数为循环阈值（Ct 值）。 以正式出版文本为准 5 SN/T 5177 2021 9.2.4.2质量控制 反应结果应同时符合以下 2 个条件： 阴性对照物扩增曲线； 阳性对照 Ct 值 35 并有明显扩增曲线。 9.2.4.3结果判断及报告 当同时进行的阳性对照和空白对照试验结果正常，本方法检验结果判定及报告如下： null 检测样品有明显的荧光扩增曲线，且 Ct 值 35 时，判为阳性，报告“检出寨卡病毒特异性 基因（实时荧光 RT PCR 法）”； null 检测样品荧光扩增曲线的 Ct 值介于 35 和 40 之间时，宜重新进行实时荧光 RT
16、-PCR 检测。 若重新检测的 Ct 值仍介于 35 和 40 之间，且曲线有明显的对数增长期，判为阳性，报告“检出寨卡 病毒特异性基因（实时荧光 RT-PCR 法）”，此类样本建议用其他方法进一步验证；否则判为阴性， 报告“未检出寨卡病毒特异性基因（实时荧光 RT-PCR 法）”。 null 检测样品无荧光扩增现象，判为阴性，报告“未检出寨卡病毒特异性基因（实时荧光 RT- PCR 法）”。 9.3寨卡病毒现场快速检测方法 9.3.1样本的采集 同 9.1。 9.3.2反应体系组成 表 3寨卡病毒现场快速检测反应体系 成分 体积 RNase-free ddH 2 O 9 L PCR 反应液（
17、一步法实时荧光 RT-PCR 试剂盒提供） 30 L 酶混合液 （一步法实时荧光 RT-PCR 试剂盒提供） 2 L 10 mM Primer F 1.5 L 10 mM Primer R 1.5 L 10 mM TaqMan Probe 1 L 模板待检尿液样本 5 L（或待检血清、血浆样本 2 L 或唾液样本 2 L +3 L DEPC 水） 5 L 注：寨卡病毒现场快速检测方法的反应总体系为 50 L ；每组实验另各设一个阴性对照和阳性对照。 9.3.3扩增程序 在不同的荧光定量 PCR 仪上，寨卡病毒快速检测的反应条件略有不同。以ABI7500荧光定量PCR 仪为例，一步法实时荧光 R
18、T-PCR 检测扩增程序如下：42 5 min 1 个循环；95 5 s，45 5 s ， 15 个循环；95 5 min 1 个循环；95 5 s，50 30 s（收集荧光），40 个循环。实验室可根据所使 用的不同试剂和仪器参考上述反应条件作适当调整。 以正式出版文本为准 6 SN/T 5177 2021 9.3.4检验结果判断及报告 反应结果应同时符合以下 2 个条件： 阴性对照物扩增曲线； 阳性对照 Ct 值 35 或无数值，则报 告为寨卡病毒阴性。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 SN/T 5177 2021 中华人民共和国出入境检验检疫 开本 8801230 1/16 印张 0.75 字数 18 千字 2021 年 7 月第一版 2021 年 7 月第一次印刷 印数 110 书号：15517574 定价 12.00 元 国境口岸寨卡病毒实时荧光 RT-PCR 检测方法 行 业 标 准 SN/T 51772021 * * * 北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023） 编辑部：（010）65194242-7531 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 中国海关出版社有限公司出版发行 网址
