1、中 华 人 民 共 和 国 公 安 部 发布 - - 实施 - 发布 布 法庭科学 生物检材 中草甘膦 和氨甲基 膦 酸检验 液 相色谱- 质 谱法 Forensic sciences Examination methods for glyphosate and aminomethyl phosphonic acid in biological samples LC-MS GA/T GA 中 华 人 民 共 和 国 公 共 安 全 行 业 标 准 ICS 13.310 CCS A 92 I 前 言 本文件 按 照 标 准化 工作 导则 第 部分： 标准 化文 件的 结构 和起草 规则 的 规定
2、 起草。 请注意 本文 件的 某些 内容 可能涉 及专 利。 本文 件的 发布机 构不 承担 识别 专利 的责任 。 本 文件 由全 国刑 事技 术标 准化技 术委 员会 毒物 分析 分技术 委员 会 （SAC/TC 179/SC 1 ） 提 出并归口。 本 文件 起草 单位 ： 贵 州省 公安厅 物证 鉴定 中心 、 公 安部物 证鉴 定中 心、 北京 市公安 局刑 侦总 队、 中 国刑事 警察 学院 、 广东 省公 安厅刑 事技 术中 心 、 湖 北省 公安司 法鉴 定中 心 、 重 庆市 公安局 物证 鉴定 中心 、 广州市 公安 局刑 事技 术所 、滨州 市公 安局 物证 检验 鉴定中
3、 心、 大连 市刑 侦支 队。 本 文件 主要 起草 人： 王立 雄、 田 仁奎、 陈实 、 高 明顺 、 张卓、 兰昭 荣、 杨英 勇、 黄健、 赵霞、 朱昱 、 张亮、 张银 华 、 郭浩 、孙 立敏 、 吴洪 振 、 王彬 。 GA/T 1 法庭科学 生 物检 材中草甘 膦和氨 甲基膦酸 检验 液 相色谱- 质谱法 1 范围 本 文件 规定 了法 庭科 学生 物检材 （血 液、 尿液 、 胃 组织、 肝脏 等） 中草 甘膦 及其代 谢物 氨甲 基膦 酸 的液相 色谱-质 谱（ ）的定 性定 量方 法。 本 文件 适用 于法 庭科 学生 物检材 （血 液、 尿液 、 胃 组织、 肝脏 等）
4、 中草 甘膦 和氨甲 基膦 酸的 定性 定 量分析 。其 他可 疑样 品可 参照使 用。 2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款 。 其 中 ， 注日 期的 引用 文件， 仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件； 不注 日期 的引 用文件 ， 其 最新 版本 （包 括所有 的修 改单 ） 适 用于 本 文件。 分 析实 验室 用 水规格 和试 验方 法 毒 物分 析名 词 术语 3 名词术 语和 定义 界定 的术 语和 定 义适用 于本 文件 。 4 原理 以空白 样品 和添 加样 品作 对照， 按平 行操 作的 要
5、求 ， 对生 物检 材进 行提 取、 净化及 浓缩 ， 采 用液 相 色谱- 质 谱法 定性 定量 ， 以 保留时 间、 质谱 特征 离子 和离子 丰度 比作 为定 性判 断依据 ； 以 峰面 积为 依据 ， 采用外 标法 进行 定量 分析 。 5 试剂 和材 料 5.1 试剂 实验用 水应 符合 中规定 的一 级水 。除 另有 说明外 ， 在 分析 中使 用的 试剂均 为色 谱纯 ，试 剂包括 ： a) 甲醇； b) 乙腈； c) 乙酸铵 ； d) 5% 氨水 ：取5mL 氨水 （优 级纯） ，加 水溶 解稀 释并 定容至100mL ； e) 5% 氨水5mmol/L 乙 酸 铵 溶 液 ：
6、 称 取 乙 酸 铵0.386g 并 移取50mL 氨 水 ， 加 水 溶 解 稀 释 并定容 至 1000mL ； f) 标准溶 液： 1) 单一 标准 物质 储 备溶液 ：根 据 草 甘膦 、氨 甲基膦 酸 标 准物 质的 纯度 和盐型 换算 后， 各称 取适 量， 用 水 分别 配制 成 草甘 膦 、 氨 甲基 膦酸 标准 物质 储 备溶液 ， 密GA/T 2 封， 保存 ，有 效 期 6 个 月。 或采 用市 售标 准溶液 ； 2) 单一标 准物 质工作 溶 液： 移 取 标 准物 质储 备 溶 液，用 水 配制 成浓 度 为 100 的单一 标准 工作 溶液 ，密 封， 保存 ，有效
7、期 3 个月 。实 验中 所用 其 他浓度 的单 一 标准工 作溶 液均 由 标 准物 质储 备溶 液配 制 得到； 3) 混合标 准物 质工作 溶 液 ： 分别移 取 草甘 膦 、 氨 甲基 膦酸 标准 物质 储 备溶液 ， 用 水配制 成浓 度 为 100 的 混合 标准 物质 工作 溶 液，密 封， 保存 ， 有效 期 3 个 月。 实 验中 所用 其他 浓度 的 混合 标准 物质 工作 溶液 均由 单一 标准 物 质储备 溶液 配制得到 。 5.2 材料 材料包 括： a) 固相 萃取 柱： 柱 或等 效固 相萃 取柱 ； 注 ：CNWCNWBOND GCB/PSA 柱是CNW 公司产
8、品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者， 并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 固 相萃 取柱 ： 柱 或等 效固 相 萃取柱 ； 注 ：Agela Cleanert NH2 柱是Agela 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示 对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 c) 具盖离 心管 ； d) 具塞玻 璃试 管； e) 有机系 微孔 滤膜 ： 。 6 仪器和 设备 仪器和 设备 包括 ： a) 液相色 谱- 串 联质 谱仪 ：配 有电喷 雾离 子源 （ESI ） 和
9、 三重四 极杆 质量 分析 器； b) 电子天 平： 分度 值 d ； c) 铰碎机 ； d) 移液器 ； e) 离心机 ； f) 振荡器 ； g) 浓缩器 。 7 操作 方法 7.1 定 性分 析 7.1.1 样品 前处 理 7.1.1.1 固 相萃 取 移 取尿 液 于具盖 离 心管中 ，加 入 水 稀释 ，得 到 尿液 稀释 液 。 移 取血 液 或称取 铰碎 的胃 组织 、 肝脏等 固体 检材样 品 于具 盖离 心 管中 ， 加 入 乙腈 水（ 体 积比 为 ） ， 振 荡 ， 以上 离心 ， 取 上清 液转移 至具塞 玻璃 试管 ， 置 于 浓 缩器 上 浓缩 至 约 ， 加水 稀释
10、 至 ,得 到 稀释液 。 将稀释 液转 移 至 固相萃 取柱 （ 使用 前依 次 用甲 醇 、水 进 行 活化 ） ， 过柱 流速 为GA/T 3 ，用 水淋 洗 ，收集 过柱 液和 淋洗 液 并 转移 至 NH 2 固相 萃取 柱 （ 使用前 依次 用甲 醇 、 水 进 行活 化 ） ，过 柱 流速 为 ， 依次用 水、 甲醇 淋洗 ， 弃去淋 洗液 ，挤干 水分 或 离心或 真空 抽固 相萃 取 柱 ，用 氨水 溶液 洗脱， 洗脱液 过 柱流 速 为 ， 洗脱液 收集 至 具 塞玻 璃试 管 ， 置 于浓 缩器 上 浓 缩至 干 ， 残 留物 用 乙腈 水 （ 体积 比为 ） 溶解， 经
11、有机 微 孔过 滤膜 过滤， 作为 检材 样品 提取 液 ，供 仪器 检测 。 注： 检材样品取样量、 稀释体积、乙腈 水（体积比为 ）体积及定容体积可根据实际情况调整。 7.1.1.2 质控 样 品制 备 取等量 相似 基质 的空 白样 品两份 于具 盖离 心管 中 ， 一份作 为空 白 样 品 ， 一 份 添加 草 甘膦 、 氨甲 基膦 酸混合 标准 物质 工作 溶液 （ 尿液 、 血 液 添 加样 品 的 浓度 为 ， 胃组 织 添 加 样品 的 浓度 为 ， 肝脏添 加样 品浓 度 为 ）， 作为 添加 样品 ， 与 检 材样品 平行 操作 ， 得 到空 白样品 提取 液和 添加 样品
12、 提取液 ，供 仪器 检测 。 7.1.2 仪器 检测 7.1.2.1 液 相色 谱- 串 联质 谱仪条 件 以下为 参考 仪器 及条 件， 可根据 不同 品牌 仪器 和不 同检材 等实 际情 况进 行调 整 ： a) 色谱柱 ：Asahipak NH2P-50 2D 液相 色谱 柱（2.0mm 150mm ，5 m ）或 其他 等 效柱； 注： 是 公司产品的商品名称，给 出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示 对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 柱温： ； c) 流动相A: 乙 腈， 流动 相B ：5%氨水5mmol/L 乙酸 铵 溶液；
13、d) 流速：0.25mL/min ； e) 洗脱： 梯度 洗脱 ，梯 度洗 脱条件 见表1； 表1 梯 度洗 脱条 件 时间 流动相 流动相 f) 扫描方 式： 负离 子扫 描(ESI ) ； g) 检测方 式: 多反 应监 测 （MRM ） ； h) 喷雾电 压：-4500V ； i) 离子源 温度 ： ； j) 气帘气 压力 ：30psi ； k) 雾化气 压力 ：55psi ； l) 辅助气 压力 ：55psi ； GA/T 4 m) 碰撞气 ：氮 气； n) 定性、 定量 离子 对 、 去簇 电压和 碰撞 能量 条件 见表2 。 表2 定性 、定 量离 子对 、去簇 电压 和碰 撞能
14、量条 件 目标物 定量离子对 m/z 定性离子对 m/z 去簇电压 碰撞能量 草甘膦 氨甲基膦酸 7.1.2.2 进样 分别吸 取 空 白溶 剂、 添加 样品 提 取液 、 空 白样 品 提 取液 、 检材 样品 提取 液 、 标准物 质工 作溶 液， 按 7.1.2.1 仪器 条件 进行 检测 。进样 顺序 和进 样次 数应 确保结 果有 效。 7.2 定 量分 析 7.2.1 样品 前处 理 移取血 液、尿 液检 材样 品1.0mL 两 份 ， 或 称取 铰碎 的胃 组织 、 肝 脏等 固体 检材 样 品1.0g 两份 ， 按7.1.1 进行操 作 ， 得到 检材 样品 提取液 ，供 仪器
15、 检测 。 取与检 材样 品等 量的 相似 基质空 白样 品 ， 与 检材 样品 平行操 作 ， 得 到空 白样 品提 取液 ， 供 仪器 检测 。 外标- 单点校正法： 取与检材样品等量的相似基质空 白样品 两份，添加草甘膦 、氨甲基膦酸 标准物 质工作 溶液 ， 作 为添 加样 品， 与 检材 样品 平行 操作 ， 得到 添加 样品 提取 液 ， 供仪器 检测 。 添 加样 品中 目 标物含 量应 在检 材样 品中 目标物 含量 的（100 50 ）% 范围 内 。 外标- 校准曲线法： 取与检材样品等量的相似基质空 白样品，添加 草甘膦、氨 甲基膦酸 标准物质 工 作 溶 液( 血 液
16、、 尿 液 基 质 的 配 制 浓度在0.2 g/mL20 g/mL 范围内, 胃 组 织 、 肝 脏 基 质 的 配 制 浓度 在 0.5 g/mL20 g/mL 范 围内)， 作 为 添 加样 品 ， 与 检材 样品平 行操 作， 得到 添加 样 品提取 液 ， 供仪 器检 测。 校准曲 线 应 不少 于6 个浓 度 点 （包 括空 白样 品） 。 检材 样品中 目标 物的 含量 应在 校准曲 线 的 线性 范围 内。 7.2.2 仪器 检测 7.2.2.1 仪 器条 件 同 。 7.2.2.2 进样 分别吸 取检 材样 品提 取液 、空白 样品 提取 液、 添加 样品提 取液 ，按 仪
17、器条件 进样 分析 。每 份检材 样品 提取 液和 添加 样品提 取液 各 进 样分 析 次。 7.2.3 计算 7.2.3.1 计 算含 量 7.2.3.1.1 外标- 单 点校 正 法 记录检 材样 品提 取液 和添 加样品 提取 液中 目标 物的 保留时 间和 峰面 积值 ，按 公式（ ） 计算 检材 样 品中目 标物 的含量 。 GA/T 5 = A A . （1） 式中： 检材 样品 中目 标物 的含 量； A 检 材样 品 提 取液 中目 标 物 的峰 面积 的平 均值 ； A 添加 样品 提取 液中 目 标物的 峰面 积的 平均 值； 添加 样品 中目 标物 的含 量 。 7.2
18、.3.1.2 外标- 校 准曲线法 记 录 检 材样 品 提取 液 和添加 样 品 提取 液 中目 标 物的保 留 时 间和 峰 面积 值 ，以 添 加 样 品提 取 液中 目 标物的 峰面 积的 平均 值为 纵坐标 、 添 加样 品提 取液 中 目标 物的 含量 为横 坐标 进行线 性回 归， 得到 线性 方 程。根 据检 材样 品提 取液 中目标 物的 峰面 积值 ，按 公式(2) 计 算出 检材 样品 中 目标物 的含量 。 = y-b a （ ） 式中： 检 材样 品中 目标 物的 含量 ； y 检 材样 品提 取液 中目 标 物的峰 面积 的平 均值 ； a 线 性方 程的 斜率 ；
19、 b 线 性方 程的 截距 。 7.2.3.2 计 算相 对相 差 记录 中 计算 得到 的 检材样 品中 目标 物的 含量 ， 按公 式 （ ） 计算 相对 相 差： 12 100% - RD = （ ） 式中 ： RD 相 对相 差， 用百 分比 （ ） 表示 ； 、 两 份检 材样 品中 目标物 的含 量； 两份检 材样 品中 目标 物 含量的 平均 值。 8 结果 评价 8.1 定 性结 果评 价 8.1.1 阳性 结果 评价 在相同 条件 下进 行样 品测 定时， 检材 样品 中目 标物 的色谱 峰保 留时 间与 标准 物质工 作溶 液 一 致 （ 相 对误差在 之 内） 、 目 标
20、物的 两对 定性 离子 对与 标准物 质工 作溶 液 一 致， 且离子 对丰 度比 与浓 度接 近 的标准 物质 工作 溶液 相比 ， 相 对偏 差不 超过 表 规 定的范 围 ， 空 白样 品无 干 扰， 则可 判断 检材 样品 中 检 出目标 物。 表3 离子 对丰 度比 的最 大允许 相对 偏差 范围 离子对丰度比 最大允许相对偏差 8.1.2 阴性 结果 评价 GA/T 6 检 材 样 品未 出 现与 目 标物标 准 物 质工 作 溶液 一 致的色 谱 峰 ，且 添 加样 品 中出现 与 目 标物 标 准物 质 工作溶 液一 致的 色谱 峰， 空白样 品无 干扰 ，则 可判 断检材 样
21、品 中未 检出 目标 物。 8.2 定 量结 果评 价 检材样 品中 目标 物含 量的RD 20% ， 定量 数据 可靠 ， 其含量 按 两 份检 材的 平均 值计算 。 检材样 品中 目标物 含量 的RD 20% ， 定量数 据不 可靠 ，应按7.2 重新提 取检 验。 相关资 料、 谱图 及检 出限 参见附 录 A 。 GA/T 7 附录 A （资料 性） 相关资 料、 谱图 及检 出限 A.1 草 甘膦 的相 关资 料 草甘膦 ， 化学 名 ： (膦 酸甲 基） 甘氨 酸 。 纯 品为 非挥 发 性白色 晶体 。 时在 水中 的溶解 度 为 ， 不溶于 一般 有机 溶剂 ， 其 异丙胺
22、盐完 全溶 解于 水。 不可燃 、 不 可爆 ， 常 温贮 存稳定 。 草 甘膦 的大 鼠急 性 经口 为 ， 小鼠经 口 为 ， 兔 急性 经皮 大于 ， 对人 、 畜低 毒。 急 性毒 性为 级， 属 于低毒 除草 剂。 草甘 膦急 性中毒 基本 由经 口误 服所 致， 生 产和 使用 中引 起全 身 急性中 毒罕 见。 急性 草甘 膦中毒 的常 见临 床表 现有 恶心、 呕吐、 头昏、 乏力 、 腹痛、 面色 苍白， 有的 病 例还可 见血 压降 低、 呼 吸 和心跳 骤停 等。 草甘 膦及 氨甲基 膦酸 的相 关信 息见 表 。 表A.1 草甘 膦及 氨甲 基膦 酸的相 关信 息 编号 中文名称 CAS 编号 英文缩写 分子式 分子量 1 草甘膦 C3H8NO5P 169.07 2 氨甲基膦酸 CH6NO3P 111.04 A.2 草甘 膦及 氨甲 基膦 酸 的相关 谱图 草甘膦 及氨 甲基 膦酸 的相 关谱图 见 图A.1 。 图A.1 草 甘膦 及氨 甲基 膦 酸MRM 色谱 图 GA/T 8 A.3 草甘 膦及 氨甲 基膦 酸 的检出 限 生物检 材 中 草甘 膦及 氨甲 基膦酸 检出 限见 表 。 表A.2 生 物检 材中 草甘 膦 及氨甲 基膦 酸的 检出 限 样品 检出限 （ ） 尿液 血液 胃组织 肝脏
