1、 ICS 13.310 CCS A 92 中 华 人 民 共 和 国 公 共 安 全 行 业 标 准 GA GA/T 法庭科学 生物检材 中雷 公藤 内酯甲等4 种雷公藤 毒素检验 液相色谱- 质谱法 Forensic sciences Examination methods for 4 tripterygium toxin including wilforlide A in biological samples LC-MS/MS - 发布 - - 实施 中 华 人 民 共 和 国 公 安 部 发布 GA/T I 前 言 本文件 按 照 GB/T 1.1 2020 标 准化 工作 导则 第 1
2、 部分： 标准 化文 件的 结构 和起草 规则 的 规定 起草。 请 注意 本文 件的 某些 内容 可能涉 及专 利。 本文 件的 发布机 构不 承担 识别 专利 的责任 。 本 文件 由全 国刑 事技 术标 准化技 术委 员会 毒物 分析 分技术 委员 会 （SAC/TC 179/SC1 ） 提 出并 归口。 本 文件 起草 单位 ： 公 安部 物证鉴 定中 心、 杭州 市公 安司法 鉴定 中心 、 广 西省 公安厅 、 云 南省 公安 厅 。 本 文件 主要 起草 人： 王芳 琳、栾 玉静 、应 剑波 、黄 克建、 李虹 。 GA/T 1 法庭科学 生 物检 材中雷公 藤内酯 甲等 4 种
3、 雷公藤 毒素检验 液相色谱- 质 谱法 1 范围 本 文件 规定 了 法 庭科 学 生 物检材 （血 、 尿 、 肝 、 肾、 胃及胃 内容 ） 中 雷公 藤内 酯甲、 雷公 藤内 酯酮 、 雷公藤 甲素 和雷 公藤 红素 的液相 色谱- 质谱 （LC-MS/MS ） 检验方 法 。 本 文件 适 用于 法庭 科学 生物 检 材 （ 血、 尿、 肝、 肾、 胃 及胃 内容 ） 中 雷公 藤内 酯 甲、 雷公 藤内 酯 酮、雷 公藤 甲素 和雷 公藤 红素 的 定性 分析 和定量 分 析。其他 检材 可 参照 使用 。 2 规 范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引
4、用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款 。 其 中 ， 注日 期的 引用 文件， 仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件； 不注 日期 的引 用文件 ， 其 最新 版本 （包 括所有 的修 改单 ） 适 用于 本 文件。 GB/T 6682 分 析实 验室 用 水规格 和试 验方 法 GA/T 122 毒 物分 析名词 术 语 3 术 语和 定义 GA/T 122 界 定的 术语和 定 义适 用 于本 文件 。 4 原理 以空白 样品 和添 加样 品作 对照， 按平 行操 作的 要求 ， 对生 物检 材进 行 提 取、 净化及 浓缩 ， 采 用液 相 色谱- 质谱 法检测 ， 以保 留
5、时间 、 质 谱特 征离 子 对 和 离子对 丰度 比作 为定 性判 断依据 ； 以峰 面积 为依 据， 采用外 标法 进行 定量 分析 。 5 试 剂和 材料 5.1 试剂 实验用 水应 符合GB/T 6682 中规 定的 一级 水 。 除 非另 有说明 ， 在分 析中 使用 的 试剂均 为分 析纯 ， 试 剂包括 ： a) 甲醇（ 色谱 纯） ； b) 乙腈（ 色谱 纯） ； c) 乙酸乙 酯； d) 1% 氢氧 化钠 溶液 ： 称 取 氢 氧化 钠 1.0g ，加 入一 定量 的水溶 解并 稀释 至 100mL ； e) 磷酸盐 缓冲 液 （pH 值 6.0）： 分别 称 取磷 酸二 氢
6、钠 8.34g 、 磷 酸氢 二钠 0.87g ， 加入一 定量 的水 溶解并 稀释 至 1000mL 。 GA/T 2 f) 10mmoL/L 醋 酸铵 溶液 （ 含 0.1% 甲酸 ）： 称取 醋酸 铵 0.384g ，加 入一定 量的 水溶解 ，并 加入 0.5mL 甲酸 混匀 ，加 水稀 释至 500mL ； g) 标准溶液 ： 1) 1.0mg/mL 标准 物质 储备 液 ：根据 雷公 藤内 酯甲 、雷 公藤内 酯酮 、雷 公藤 甲素 和雷公 藤红 素标准 物质 的纯 度 ， 分 别 用甲醇 配 制 1.0mg/mL 雷 公 藤内酯 甲 、 雷 公藤 内酯 酮 、 雷 公藤 甲 素和
7、雷 公藤 红素 标准 物质 溶液， 密封 ，0 4 保存， 有效 期 6 个月 。 或 采用 市售标 准溶 液； 2) 0.1mg/mL 混合 标准 物质 工 作溶液 ： 分别 移取 1.0mg/mL 的 雷公 藤内 酯甲 、 雷 公 藤内酯 酮、 雷公藤 甲素 和雷 公藤 红素 标准物 质溶 液 各 1.0mL ， 用甲醇 配制 成浓 度 为 0.1mg/mL 的 混合 标准物 质工 作溶 液 ， 密封 ，0 4 保存 ， 有 效期 3 个月。 实验 中所 用其他 浓 度的混 合标 准工作 溶液均由 0.1mg/mL 混合标 准工 作溶 液 配 制得 到； 3) 10.0g /mL 单一 标
8、 准物 质 工作溶 液 ： 分别 移取 1.0mg/mL 的雷 公藤 内酯 甲、 雷 公藤内 酯酮 、 雷公藤 甲素 和雷 公藤 红素 标准物 质 储 备液 ， 用 甲醇 配 制成浓 度 为 10.0g /mL 的 单一标 准工 作溶液 ， 密 封，0 4 保 存， 有 效期 3 个 月。 实验 中所用 其他 浓度 的单 一标 准 物质 工作 溶液均 由 10.0g /mL 单一 标准物 质工作 溶 液配 制得 到。 5.2 材料 材料包 括： a) 固相萃 取柱 ：Oasis HLB 固相萃 取柱 或其 他等 效固 相萃取 柱； 注：Oasis HLB 柱是 Waters 公司产品的商品名称
9、， 给出这一信息是为了方便本标准的使用者， 并不是表示对该产 品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 有机系 微孔 滤膜 ：0.22 m ； c) 一次性 注射 器； d) 具盖离 心管 。 6 仪 器和 设备 仪器和 设备 包括 ： a) 液相色 谱- 串 联质 谱仪 ：配 有电喷 雾离 子源 （ESI ） 和 三重四 极杆 质量 分析 器； b) 电子天 平： 分度 值 d 0.01mg ； c) 离心机 ； d) 超声波 清洗 器； e) 振荡器 ； e) 移液器 ； f) 浓缩器 。 7 操 作方 法 7.1 定性 分析 7.1.1 样品 前 处理 7.
10、1.1.1 液液 萃取 移取血 液等 液体 检材 样 品 1.0mL ，或 称取 铰碎 的肝 脏 等 固体 检材 样 品 1.0g 于 具 盖离心 管中 ，加 入GA/T 3 氢氧化 钠溶 液 调 pH 值 9pH 值 10 ， 再 加入 乙酸 乙酯 5mL ， 振荡 10min ， 不低 于 8000r/min 离心 10min ， 分离有 机相 ；重 复提取 一 次 ，合 并两 次提 取的有 机 相 ，置 于浓 缩器 上 50 下 浓缩至 干 ， 残留 物用初 始 流动 相 0.5mL 溶解 ， 经 0.22 m 有 机系 微孔 滤膜 过滤 ， 作为 检材 样品 提取 液 ， 供仪器 检测
11、 。 注： 检材样品取样量、提取溶剂体积可根据实际情况调整。 7.1.1.2 固相 萃取 移取血 液等 液体 检材 样 品 1.0mL ，或 称取 铰碎 的肝 脏 等固 体 检材 样 品 1.0g 于 具 盖离心 管中 ，加入 磷酸盐 缓冲 液 4mL ， 混匀 ，超声 15min ， 不低于 8000r/min 离心 20min ， 取上 清液转 移至 已活 化 好 （依 次用甲 醇 3mL、水 3mL 活化 ） 的固 相萃 取柱 中 ， 控 制上清 液过 柱流 速低于 1.0mL/min ， 依 次用 水 3mL 、 甲醇/ 水 （体 积比 5:95 ）3mL 淋洗 ，弃 去淋 洗液 ，
12、挤干水 分或 离心 或真 空抽 固相萃 取柱 2min ，用 4mL 甲醇洗 脱 ， 收 集洗 脱液 并 置于浓 缩器 上 5 0 下 浓缩 至干 ， 残 留物 用初 始流 动 相 0.5mL 溶 解 ， 经 0.22 m 有机系 微孔 滤膜 过滤 ，作 为检材 样品 提取 液， 供仪 器检测 。 注： 检材样品取样量可根据实际情况调整。 7.1.1.3 质控 样品 制备 取等量 相似 基质 的空 白样 品 （ 若无 相似 基质 空白 样 品可用 血液 替代 ） 两份 于 具盖离 心管 中 ， 一 份作 为空白 样品 ， 一 份添 加 标 准物质 工作 溶液 ， 使 雷公 藤内酯 甲、 雷公
13、藤内 酯酮 、 雷公 藤甲 素和 雷公 藤红 素 浓 度为20ng/mL （g）， 作为 添加样 品 ，与 检材样 品平 行操作 ，得到 空白样 品提 取液和 添加样 品提取 液 供仪器 分析 。 7.1.2 仪 器检 测 7.1.2.1 液相 色谱- 串联 质谱 仪 条件 以下为 参考 条件 ，可 根据 不同品 牌仪 器和 不同 样品 等实际 情况 进行 调整 ： a) 色谱柱 ：Kinetex C 18(3.0mm 50mm ，2.6 m) 柱或 等 效色谱 柱； 注： Kinetex C 18 柱为 Phenomenex 公司产品的商品名称， 给出这一信息是为了方便本标准的使用者， 并不
14、是表示 对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 柱温箱 ：40 ； c) 流动 相 A ：10mmoL/L 醋 酸铵溶 液（含 0.1%甲酸 ）； d) 流动 相 B ：甲 醇； e) 流速：0.5mL/min ； f) 进样体 积： 10L ； g) 洗脱方 式： 梯度 洗脱 ， 梯 度洗脱 条件 见 表 1； 表1 梯 度洗 脱条 件 时间 min 流动相 A 流动相 B 0 0.2 95% 5% 3.0 5% 95% 4.0 5% 95% 5.1 95% 5% 7.0 95% 5% h) 扫描方 式： 正离 子扫 描(ESI + ) ； GA/T 4
15、 i) 检测方 式： 多反 应监 测(MRM) ； j) 电喷雾 电压 ：5500V ； k) 离子源 温度 ： 65 0 ； l) 雾化气 压力 ：55psi ； m) 气帘气 压力 ：50psi ； n) 辅助气 压力 ：50psi ； o) 定性、 定量 离子 对和 去簇 电压、 碰撞 能量 条件 见 表2。 表2 定性 、定 量离 子对 和 去簇 电压 、碰 撞能 量条 件 目标物 定量离子 m/z 定性离子 m/z 去簇电压 V 碰撞能量 eV 雷公藤甲素 361.2 145.0 361.2 145.0 147 35 361.2 157.0 137 35 雷公藤内酯酮 359.1 1
16、97.2 359.1 197.2 150 35 359.1 241.1 150 36 雷公藤内酯甲 472.4 191.2 472.4 191.2 60 24 472.4 247.2 60 29 雷公藤红素 451.4 201.1 451.4 201.1 50 29 451.4 215.2 58 24 7.1.2.2 进样 分别吸 取 空 白溶 剂、 添加 样品 提 取液 、 空 白样 品 提 取液 、 检材 样品 提取 液 、 标准物 质工 作溶 液， 按 7.1.2.1 仪器 条件 进行 检测 。进样 顺序 和进 样次 数应 确保结 果有 效。 7.2 定量 分析 7.2.1 样品 前 处
17、理 移取血液等 液体检材 样品1.0mL ，或称取铰碎的 肝脏等固体检材样品1.0g 两份 ，按7.1.1进行操作， 得到空 白样 品提 取液 ，供 仪器检 测 。 取与检 材样 品等 量的 相似 基质空 白样 品， 与检 材样 品 平行操 作， 得到 空白 样品 提 取液 ， 供仪 器检测 。 取与检 材样 品等 量的 相似 基质空 白样 品 两 份 ， 添 加 雷公藤 内酯 甲 、 雷 公藤 内 酯酮 、 雷 公藤 甲素 和雷 公藤红 素 标 准物 质工 作溶 液 ， 作 为添 加样 品， 与检 材 样品平 行操 作， 得到 添加 样品提 取液 ， 供 仪器 检测 。 检材样 品中 目标
18、物含 量应 在添加 样品 中目 标物 含量 的（100 50 ）% 范 围内 。 7.2.2 仪 器检 测 7.2.2.1 仪器 条件 同 7.1.2.1 。 7.2.2.2 进样 分别吸 取 检 材样 品提 取液 、空白 样品 提取 液、 添加 样品提 取液 ，按 7.1.2.1 仪 器条件 进样 分析 。每 份检材 样品 提取 液和 添加 样品提 取液 各进 样分 析 2 3 次。 7.2.2.3 计算 7.2.2.3.1 计算 含量 GA/T 5 记录检 材样 品提 取液 和添 加样品 提取 液中 目标 物的 保 留时 间和 峰面 积值 ，按 公式（1） 计算 检材 样 品中目 标物 的
19、含量 。 . （1） 式中： 检 材样 品中 目标 物的 含量； A 检 材样品 提取 液 中目标 物的 峰面 积 的 平均 值 ； A 添加 样品 提取 液 中目 标物 的峰 面积 的平 均值 ； 添 加样 品中 目标 物的 含量 。 7.2.2.3.2 计 算相 对相 差 记录 7.2.3.1 中 计算 得到 的 检材样 品中 目标 物的 含量 ， 按公 式 （2） 计算 相对 相 差： 12 100% - RD = . （2 ） 式中 ： RD 相 对相 差， 用百 分比 （% ） 表示 ； 1 、 2 两 份检 材样 品中 目标物 的含 量； 两份检 材样 品中 目标 物 含量的 平均
20、 值。 8 分 析结 果评 价 8.1 定 性结 果评 价 8.1.1 阳 性结 果评 价 在相同 条件 下进 行样 品测 定时， 检材 样品 中目 标物 的色谱 峰保 留时 间与 标准 物质工 作溶 液 一 致 （ 相 对误差在 2.5% 之 内 ） 、 目 标物的 两对 定 性 离子 与 标 准物质 工作 溶液 一致 ， 且 离子 对 丰度 比与 浓度 接近 的标准 物质 工作 溶液 相比 ， 相 对偏 差不 超过 表 3 规 定的范 围 ， 空 白样 品无 干 扰， 则可 判断 检材 样品 中 检 出目标 物。 雷公 藤内 酯甲 、雷公 藤内 酯酮 、雷 公藤 甲素和 雷公 藤红 素 相
21、 关谱 图 参见 附录 A 。 表 3 离子 对丰 度比 的最 大允许 相对 偏差 范围 离子对丰度比 50% 20% 50% 10% 20% 1 0 % 最大允许相对偏差 20% 25% 30% 50% 8.1.2 阴 性结 果评 价 检材样 品未 出现 与目 标物 标准 物 质工 作 溶 液一 致的 色谱峰 ， 且 添加 样品 中出 现 与目标 物标 准 物 质工 作溶液 一致 的色 谱峰 ，空 白样品 无干 扰， 则可 判断 检材样 品中 未检 出目 标物 。 8.2 定量 结果 评价 检 材样 品中 目 标物含 量的RD 20% ，定 量数据 可靠， 其含 量按 两 份检材 的平均 值
22、计 算。如 果检 材 样品中 目标 物含 量的RD20% ，定 量数 据不 可靠 ，应按7.2 重新 提取 检验 。 雷公藤 内酯 甲、 雷公 藤内 酯酮、 雷公 藤甲 素和 雷公 藤红素 相关 参考 资料 参见 附录 B 。 A B GA/T 6 附 录 A （资料 性 ） 雷公藤 内酯 甲、 雷公 藤内 酯酮、 雷公 藤甲 素和 雷公 藤红素 的相 关谱 图 A.1 雷 公藤 甲素 的LC-MS/MS 谱 图见图 A.1 。 图A.1 雷 公藤 甲素LC-MS/MS 谱图 A.2 雷公 藤内 酯酮 的LC-MS/MS 谱图 见图A.2 。 图A.2 雷 公藤 内酯 酮 LC-MS/MS 谱
23、图 GA/T 7 A.3 雷公 藤内 酯甲 的 LC-MS/MS 谱图 见图A.3 。 图A.3 雷 公藤 内酯 甲 LC-MS/MS 谱图 A.4 雷 公藤 红素 的LC-MS/MS 谱 图见图 A.4 。 图A.4 雷公 藤红 素 LC-MS/MS 谱图 GA/T 8 附 录 B （资料 性 ） 雷公藤 内酯 甲、 雷公 藤内 酯酮、 雷公 藤甲 素和 雷公 藤红素 的相 关资 料 雷公藤(Triptergium wilfordii Hook.f) 是卫 矛科 一年 生藤 本植物 ，是 我国 传统 医学 中的一 种常 用中 草 药。 雷 公藤 为卫 矛科 植物 雷公藤 的根 。 分 布于
24、长江 流域以 南及 西南 ， 主 产于 长江中 、 下 游地 区。 有报 道 称， 目 前从 雷公 藤属 植物 中分离 得 100 余 种成 分， 主要是 二萜 类、 三萜 类、 倍半萜 类及 生物 碱类 等， 研 究表明 ， 生 物碱 、 二 萜类 等 许多成 分既 是有 效成 分又 是有毒 成分 ， 以 二萜 类化 合物毒 性最 强， 主要 对心 、 肝、胃 肠道 及骨 髓等 器官 损伤严 重。 雷 公藤 甲素 和雷 公藤 内酯醇(tripchlorolide) 是 雷 公藤中 活性 最高 的环 氧二 萜内酯 化合 物， 同时 也是 雷公藤 引起 毒副 作用 的主 要成分 ，对 心、 肝、
25、 骨髓 、胸、 脾、 肾及 生殖 系统 等都有 一定 的毒 性。 雷 公藤 红素 是雷 公藤 三萜类 成分 ， 是雷 公藤 中 分离到 的 第 1 个 单体 ， 虽 具有多 种药 理活 性 ， 但 却 是 主要的 毒性 成分 ，且 在雷 公藤药 物尤 其是 根皮 、茎 皮重含 量很 高。 雷公藤 内酯 甲（Wilforlide A ） ，分 子式 为 C 30H 46O 3 ，CAS 号为 84104-71-2 ， 结构式 见 图 B.1 。 雷公藤 内酯 酮（Triptonide ）， 分 子式 为 C 20H 22O 6 ，CAS 号为 38647-11-9 ， 结 构 式见 图 B.2 。 雷公藤 甲素 （Triptolide ） ，分子 式 为 C 20H 24O 6 ，CAS 号为 38748-32-2 ， 结 构 式见 图 B.3 。 雷公藤 红素 （Celastrol ）， 分子式 为 C 29H 38O 4 ，CAS 号为 34157-83-0。 结构 式 见图 B.4 。 图B.1 雷 公藤 内酯 甲结构式 图B.2 雷公 藤内 酯酮 结构 式 GA/T 9 图B.3 雷公 藤甲 素结 构式 图 B.4 雷 公藤 红素 结构 式 _
