1、 ICS 13.310 CCS A 92 中 华 人 民 共 和 国 公 共 安 全 行 业 标 准 GA GA/T 法庭科学 生物检材中夹竹桃苷和夹竹桃苷乙 检验 液相色谱-质谱法 Forensic sciences Examination methods for oleandrin and adynerin in biological samples LC-MS - 发布 - - 实施 中华人民 共和 国 公安部 发 布 GA/T 1 前 言 本文件 按 照 GB/T 1.1 2020 标 准化 工作 导则 第 1 部分： 标准 化文 件的 结构 和起草 规则 的 规定 起草。 请注意 本
2、文 件的 某些 内容 可能涉 及专 利 。 本文 件的 发布机 构不 承担 识别 专利 的责任 。 本 文件 由全 国刑 事技 术标 准化技 术委 员会 毒物 分析 分技术 委员 会(SAC/TC 179/SC1) 提出 并归 口。 本 文件 起草 单位 ： 公 安部 物证鉴 定中 心 、 杭州 市公 安司法 鉴定 中心 、中 国人 民公安 大学 。 本 文件 主要 起草 人： 王芳 琳 、栾 玉静 、姚 伊人 、 应 剑波 、 何洪 源。 GA/T 2 法庭科学 生 物检 材 中夹竹 桃苷和 夹竹桃苷 乙 检验 液相色谱- 质谱 法 1 范围 本 文件规 定 了 法庭科学领域生物检材 （血
3、液 、尿 液 ） 中 夹 竹 桃 苷 、 夹竹桃苷乙 的 液 相 色 谱- 质谱 （LC-MS ）检 验方 法。 本 文件 适 用于 法庭 科学 领域 生物 检 材（ 血液 、尿 液） 中 夹竹 桃苷 、夹 竹桃 苷乙 的 定性 分析 和定量 分析。 其他 检材 可参 照使 用。 2 规 范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款 。 其 中 ， 注日 期的 引用 文件， 仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件； 不注 日期 的引 用文件 ， 其 最新 版本 （包 括所有 的修 改单 ） 适 用于 本 文件。 GB/T 668
4、2 分 析实 验室 用 水规格 和试 验方 法 GA/T 122 毒 物分 析名 词 术语 3 术 语和 定义 GA/T 122 界 定的 术语 和定 义适用 于本 文件 。 4 原理 以 空白 样品 和添 加样 品作对 照， 按平 行操 作的 要求， 对生 物检 材进 行 提 取、 净 化及 浓缩 ， 采 用液 相 色谱- 串联 质谱法检测 ， 以保留时间、质谱特征离 子 对和离子对丰度比作为定 性判断依据；以峰面积为 依据， 采用 外标 法 进 行定 量分析 。 5 试 剂及 材料 5.1 试剂 实验用 水应 符 合GB/T 6682 中规 定的 一级 水 。 除 非另 有说明 ， 在分
5、析中 使用 的 试剂均 为色谱 纯， 试 剂包括 ： a) 乙腈； b) 甲醇； c) 甲酸； d) 甲酸铵 ； e) 磷酸盐 缓冲 液（pH 值 6.0 ） ：称 取 磷酸 二氢 钠（ 分析 纯）8.34g 、磷 酸氢 二钠 （ 分析纯 ）0.87g ， 于 1000mL 容量 瓶中 ，加 水溶解 ，并 稀释 至刻 度； f) 10mmoL/L 甲 酸铵溶 液 （ 含 0.1% 甲酸） ： 称 取甲 酸 铵 0.62g ， 加 水溶 解后， 再 加入 100 L 甲酸， 用水稀 释 至 1000mL ； g) 标准物 质溶 液： GA/T 3 1) 1.0mg/mL 标准 物质 储备 液 ：
6、根据 夹竹 桃苷 和夹 竹桃 苷乙 标 准物 质的 纯度 ，称取 适量 ，用 甲醇分别 配制 成 1.0mg/mL 夹竹桃 苷 、 夹 竹桃 苷乙 标 准物质 储备 液， 密封，0 4 保存 ， 有效 期 6 个月 。 或采 用市 售标准 溶液 ； 2) 10.0g /mL 单一 标 准物 质 工作溶 液： 移取 1.0mg/mL 标准 物质 储备 液，用 甲醇 配制 成浓 度 为 10.0g /mL 的 单一 标准 工作 溶 液， 密封 ，0 4 保存， 有效 期 3 个月 。 实 验中所 用其 他浓度 的单 一标 准工 作溶 液均 由 10.0g /mL 单一 标 准物质 工作 溶 液 配
7、制 得到 ； 3) 0.1mg/mL 混合 标准 物质 工作 溶液 ：分 别移 取 1.0mg/mL 的 夹竹 桃苷 、夹 竹桃 苷乙 标 准物 质储备 溶液 ，用 甲醇 配制 成浓度 为 0.1mg/mL 的 混合 标准 物质 工作 溶液 ，密 封，0 4 保存 ， 有效期 3 个月。 实 验中 所 用其 他浓 度的 混合 标准物 质工 作溶 液均 由 0.1mg/mL 混合 标准物 质工作 溶 液配制 得到 。 5.2 材料 材料包 括： a) 一次性 注射 器 ； b) 液液支 撑固 相 萃 取柱 ：ISOLUTE SLE+液液 支 撑固 相 萃取柱 ； 注：ISOLUTE SLE+ 液
8、液支撑固相萃取柱 是 Biotage 公司产品 的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用 者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 c) 具盖离 心管 ； d) 有机系 微孔 滤膜 ：0.22 m 。 6 仪 器和 设备 仪器和 设备 包括 ： a) 液相色 谱- 质谱 仪， 配有 电 喷雾离 子 源 （ESI ） 和三 重 四极杆 质量 分析 器； b) 电子天 平 ： 分度值 d0.01mg ； c) 离心机 ； d) 振荡器； e) 移液器 ； f) 浓缩器 。 7 操作 方法 7.1 定 性分 析 7.1.1 样品 前处 理 7.1.1
9、.1 液 液萃 取 移取血 液等 液体 检材 样品 1.0mL 于 具盖 离心 管中 ， 加 入乙酸 乙酯 5mL ， 振荡 10min ， 不低 于 8000r/min 离心 10min ， 分离 有机 相 ； 重复 提取 一次 ，合 并两 次提取 的有 机相 ，置 于 浓 缩器上 40 下浓缩 至干 ， 残留物 用初 始流 动 相 0.5mL 溶解 ， 经 0.22 m 有 机系 微孔滤 膜过 滤 ， 作 为检 材 样品提 取液 ， 供仪 器检测 。 注：检材样品取 样量、提取溶剂体积可根据实际情况调整。 7.1.1.2 液 液支 撑固 相萃 取 移取血 液 等 液体 检材 样品 0.5m
10、L 于具 塞试 管中 ， 加入 磷酸 盐缓 冲 液 0.5mL ， 混匀， 将样 品加 入液 液GA/T 4 支撑固 相 萃 取柱 中 ， 用 正 压将样品 压 入柱 中 ， 静置 5min ， 乙 酸乙 酯 8mL 分 两 次加入 到萃 取柱 中 ， 流速 控制为 0.5mL/min 1.0mL/min ； 再将 柱中 残余 的液 体 挤出 。 收集 流出 液 ， 置于 浓缩器 上 40 下 浓缩至 干， 残留 物用 初始 流动 相 0.5mL 溶解 ， 经 0.22 m 有 机系微 孔滤 膜过 滤 ， 作 为 检材样 品提 取液 ， 供仪 器 检测。 注： 检材样品取样量和 定容体积可根据
11、实际情况调整。 7.1.1.3 质 控样 品制 备 取 等量 相 似 基质 的 空 白样 品 （若 无 相似 基质 空白 样 品可用 血液 替代 ） 两份 于 具盖离 心管 中 ， 一 份 作 为空白 样品 ，一份 添 加标 准物质 工作 溶液 ，使 夹竹 桃苷 、 夹竹 桃苷 乙浓度 为20ng/mL ， 作为 添加 样品 ， 与检材 样品 平行 操作 ，得 到空白 样品 提取 液和 添加 样品提 取液 ，供 仪器 检测 。 7.1.2 仪器 检测 7.1.2.1 仪 器条 件 以下为 参考 条件 ，可 根据 不同品 牌仪 器和 不同 样品 等实际 情况 进行 调整 ： a) 色谱柱 ：ki
12、netex C 18 (3.0mm 50mm ，2.6 m）； 注： kinetex C 18 色谱 柱是 Phenomenex 公司产品的商品名称 ，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是 表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 柱温：40 ； c) 流动相A ：乙 腈 ； d) 流动相B ： 10mmoL/L 甲 酸铵溶液 （ 含0.1%甲酸 ） ； e) 流速：0.5mL/min ； f) 进样体 积：10L ； g) 洗脱： 梯度 洗脱 ，梯 度洗 脱条件 见表1； 表 1 流动 相和 梯度 洗脱 条 件 时间 min 流动相 A 流动相
13、 B 0 0.2 10% 90% 3.0 95% 5% 5.0 95% 5% 5.1 10% 90% 7.0 10% 90% h) 扫描方 式： 正离 子扫 描(ESI + ) ； i) 检测方 式： 多反 应监 测(MRM) ； j) 离子源 温度 ：550 ； k) 雾化气 压力 ：55psi ； l) 电喷雾 电压 ：5500V ； m) 气帘气 压力 ：35psi ； n) 辅助气 压力 ：55psi ； o) 定性、 定量 离子 对和 去簇 电压、 碰撞 能量 条件 见 表 2。 GA/T 5 表2 定性 、定 量离 子对 和 去簇 电压 、碰 撞能 量条 件 目标物 定量离子对 m
14、/z 定性离子对 m/z 去簇电压 V 碰撞能量 eV 夹竹桃苷 577.5 373.3 577.5 373.3 105 19 577.5 433.3 105 13 夹竹桃苷乙 534.4 373.3 534.4 373.3 26 15 534.4 113.2 20 18 7.1.2.2 进样 分别吸 取 空 白溶 剂、 添加 样品 提 取液 、 空 白样 品 提 取液 、 检材 样品 提取 液 、 标准物 质工 作溶 液， 按 7.1.2.1 仪器 条件 进行 检测 。进样 顺序 和进 样次 数应 确保结 果有 效。 7.2 定 量分 析 7.2.1 样品 前处 理 移取血 液等 液体 检材
15、 样品1.0mL两份 ， 按7.1.1 进 行操 作 ，得 到空 白样 品提 取液 ，供仪 器检 测 。 取与检 材样 品等 量的 相似 基质空 白样 品 ， 与 检材 样 品平行 操 作 ， 得到 空白 样 品提取 液 ， 供 仪器 检测 。 取与检 材样 品等 量的 相似 基质空 白样 品 两 份 ， 添 加 夹竹桃 苷 、 夹 竹桃 苷乙 标 准物质 工作 溶液 ， 作为 添加样 品， 与检 材样 品平 行操作 ， 得 到添 加样 品提 取液 ， 供仪 器检 测 。 检材 样品中 目标 物含 量应 在添加 样品中 目标 物含 量的 （100 50 ）% 范围 内 。 注： 检材样品取样量
16、、提取溶剂体积 等可根据实际情况调整。 7.2.2 仪 器检 测 7.2.2.1 仪 器条 件 同 7.1.2.1 。 7.2.2.2 进样 分别吸 取 检 材样 品提 取液 、空白 样品 提取 液、 添加 样品提 取液 ，按 7.1.2.1 仪 器条件 进样 分析 。每 份检材 样品 提 取 液和 添加 样品提 取液 各进 样分 析 2 3 次。 7.2.3 计算 7.2.3.1 计 算含 量 记录检 材样 品提 取液 和添 加样品 提取 液中 目标 物的 保留时 间和 峰面 积值 ，按 公式（1） 计算 检材 样 品中目 标物 的含量 。 . (1) 式中： 检 材样 品中 目标 物的 含
17、量； A检 材样品 提取 液 中目标 物的 峰面 积 的 平均 值 ； A 添加 样品 提取 液 中目 标 物 的峰 面积 的平 均值 ； 添加 样品 中目 标物的 含量 。 GA/T 6 7.2.2.3.2 计 算相 对相 差 记录 7.2.3.1 中 计算 得到 的 检材样 品中 目标 物的 含量 ， 按公 式 （2） 计算 相对 相 差： 12 100% - RD = . （2） 式中： RD相 对相 差， 用百 分比 （% ） 表示 ； 1 、 2 两 份检 材样 品中 目标物 的含 量； X 两份 检材 样品 中目 标物 含量的 平均 值。 8 分 析结 果评 价 8.1 定 性结
18、果评 价 8.1.1 阳 性结 果评 价 在相同 条件 下进 行样 品测 定时， 检材 样品 中目 标物 的色谱 峰保 留时 间与 标准 物质工 作溶 液 一 致 （ 相 对 误差 在 2.5% 之内 ） 、 目 标 物的两 对定 性离子 与 标准 物质工 作溶 液 一致 ，且离 子 对丰 度比 与浓度 接近 的标准 物质 工作 溶液 相比 ， 相 对偏 差不 超过 表 3 规 定的范 围 ， 空 白样 品无 干 扰， 则可 判断 检材 样品 中 检 出目标 物。 夹竹 桃苷 和夹 竹桃苷 乙的 相关 谱图 和检 出限参 见附 录 A 。 表 3 离子 对丰 度比 的最 大允许 相对 偏差 范
19、围 离子对丰度比 50% 20% 50% 10% 20% 10% 最大允许相对偏差 20% 25% 30% 50% 8.1.2 阴 性结 果评 价 检材样 品未 出现 与目 标物 标准 物 质工 作 溶 液一 致的 色谱峰 ， 且 添加 样品 中出 现 与目标 物标 准 物 质工 作溶液 一致 的色 谱峰 ，空 白样品 无干 扰， 则可 判断 检材样 品中 未检 出目 标物 。 8.2 定量 结果 评价 检 材样 品中 目 标物含 量的RD 20% ，定 量数据 可靠， 其含 量按 两 份检材 的平均 值计 算。检 材样 品 中目标 物含 量的RD20% ，定量 数据 不可 靠 ， 应按7.2
20、 重新 提取 检验 。 夹竹桃 苷和 夹竹 桃苷 乙 的 相关参考 资料 参 见附 录 B 。 GA/T 7 A A 附 录 A （资料 性 ） 夹竹桃 苷和 夹竹 桃苷乙 的 相关谱 图 及 检出 限 A.1 夹 竹桃 苷二 级质 谱图 见图A.1 。 图A.1 夹 竹桃 苷 质 谱图 A.2 夹 竹桃 苷乙 二级 质谱 图 见图A.2 。 图A.2 夹竹 桃苷 乙质 谱 图 GA/T 8 A.3 夹 竹桃 苷MS/MS 色谱 图 见图A.3 。 图A.3 夹竹 桃苷MS/MS色谱图 A.4 夹 竹桃 苷乙MS/MS色谱图 见图A.4 。 图A.4 夹竹 桃苷 乙MS/MS 色 谱图 A.5
21、 LC-MS/MS 分 析， 夹竹 桃苷和 夹竹 桃苷 乙的 检出 限 均为0.5ng/mL 。 GA/T 9 附 录 B （资料 性 ） 夹竹桃 参考 资料 B.1 中 毒症 状 夹竹桃（Nerium indicum.Mill) 为夹竹桃属常绿灌木。现代医学研究证明 ， 夹竹桃味苦性寒,具有强 心、 利 尿、 抗癌 、 抗 炎、 镇静安 神等 作用 ， 但 是夹 竹桃的 叶 、 皮、 根、 花均 有毒， 日常 生活 当中 ， 常 因 药用或 误服 过量 夹竹 桃而 出现头 痛 、 头 晕 、 恶 心 、 呕 吐、 腹痛 、 腹泻 、 谵语 、 甚 则汗出 肢厥 、 心律 失常 、 直至休 克死 亡。 夹竹 桃叶 对小鼠 的 LD 50 为 2278.3mg/kg 。 夹 竹桃 苷(Oleandriin) ，C 32H 48O 9 ，CAS 号 465-16-7，结 构式 见图 B.1 。 夹竹桃 苷乙(Adynerin) ，C 31H 46O 6 ，CAS 号 35109-934 ，结构 式见 图 B.2 。 图B.1 夹 竹桃 苷 结 构式 图B.2 夹 竹桃 苷乙 结构 式 _
