1、 ICS 13.310 CCS A 92 中 华 人 民 共 和 国 公 共 安 全 行 业 标 准 GA GA/T 法庭科学 毛发中地 西泮等 18 种苯二氮 类药物检 验 液 相色 谱- 质 谱法 Forensic sciences Examination methods for 18 benzodiazepines including diazepam in hair samples LC-MS - - 实施 - - 发布 中华人民 共和国 公安部 发 布 GA/T I 前 言 本文件 按 照 标 准化 工作 导则 第 部分： 标准 化文 件的 结构 和起草 规则 的 规定 起草。 请注
2、意 本文 件的 某些 内容 可能涉 及专 利。 本文 件的 发布机 构不 承担 识别 专利 的责任 。 本文件 由全 国刑 事技 术标 准化技 术委 员会 毒物 分析 分技术 委员 会 （ ） 提 出并归 口 。 本文件 起草 单位 ：司 法鉴 定科学 研究 院。 本文件 主要 起草 人： 向平 、沈敏 、刘 伟、 严慧 、沈 保华、 卓先 义、 吴何 坚 。 GA/T 1 法庭科学 毛 发中 地西泮 等18 种苯 二氮类 药物检 验 液相色谱- 质 谱法 1 范围 本 文 件 规 定 了 法 庭 科 学 领 域 毛发 中 地 西 泮 等18 种 苯 二 氮 类 药 物 的 液 相 色 谱-
3、串联 质 谱 （LC- MS/MS ） 检验 方法 。 本文件 适用 于 法庭 科 学领域 毛发中 地 西 泮等18 种苯二 氮 类药 物 的定 性 定量分 析 。 其他 富 含角 蛋 白的检 材可 参照 使用 。 2 规 范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款 。 其 中 ， 注日 期的 引用 文件， 仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件； 不注 日期 的引 用文件 ， 其 最新 版本 （包 括所有 的修 改单 ） 适 用于 本 文件。 分 析实 验室 用 水规格 和试 验方 法 GA/T 122 毒物 分析 名词 术
4、语 3 术 语和 定义 GA/T 122 界 定的 术语 和定 义适用 于本 文件 。 4 原理 以 空 白 样品 和 添加 样 品作对 照 ， 按平 行 操作 的 要求， 对 毛 发检 材 中 地 西 泮等18 种苯二氮 类 药物 （详见 附录A ） 进 行提 取后 ， 采 用液 相色 谱- 串联 质谱 法检测 ， 以保 留时 间、 质 谱特征 离子 对和 离子 对丰 度比作 为定 性判 断依 据； 以峰面 积作 为依 据， 采用 外标法 或内 标法 进行 定量 分析。 5 试 剂和 材料 5.1 试剂 实验用 水应 符合 中规 定的 一级 水。 除 非另 有说明 ， 在 分析 中使 用的
5、试剂均 为色 谱纯 ， 试 剂包括 ： a) 甲醇； b) 乙腈； c) 甲酸； d) 乙酸胺 ； e) 丙酮： 分析 纯； f) 二氯甲 烷： 分析 纯； g) 20mmol/L 乙酸 铵和 0.1% 甲酸缓 冲液 ：分 别称 取 1.54g 乙酸 铵和 1.84g 甲酸 ， 加水溶 解稀 释 并 定容 至 1000mL ； h) pH 值 9.2 的 硼砂 缓冲液 ： 称取 3.80g 硼砂(Na 2B 4O 7 10H 2O) ， 加水 稀释 并定容 至 1000mL ； i) 标准物质 溶 液： GA/T 2 1) 1.0mg/mL 单一 标准 物质 储 备 溶液 ： 根 据 18 种
6、苯 二氮 类药 物标 准物 质的 纯度 和盐型 换算 后， 各 称取 适量， 用甲 醇 分别配 制 成 1.0mg/mL 单 一 标准物 质储 备 溶 液， 混 匀 ， 密封， 置 于冰箱 中冷 冻保 存 ， 有效 期 12 个月 。或 采用 市售 单 一标准 溶液 ，特 殊情 况下 可使用 对照 溶液代 替标 准溶 液； 2) 单一 标准 物质 工 作溶液 ： 移取 1.0mg/mL 标 准物质 储备 溶液 ， 用甲 醇 配制成 浓度 为 g/mL 的 单一 标准 工 作溶液 ，密 封， 置于 冰箱 中冷藏 保存 ，有 效期 3 个 月。实 验中 所用其 他浓 度的 单一 标准 工作溶 液均
7、 由 标 准物质 工作 溶液 逐级 稀释 得到； 3) 混合 标准 物质 工 作溶液 ： 分 别 移取 1.0mg/mL 的 单一 标准 物质 储备 液 ， 用 甲醇 配 制成浓 度 为 的 混 合标准 物质 工作 溶液 ， 混 匀， 密封 ， 置于 冰箱 中冷 藏 保存 ， 有 效 期 3 个月。 实验 中所 用其 他浓度 的混 合标 准工 作溶 液均由 混 合标 准 物质工 作溶 液用甲 醇 逐 级稀 释 得 到； 4) 0.1mg/mL 内标 标准 物质 储 备 溶液 ： 市售 0.1mg/mL 地 西泮-D5 的甲 醇溶液 ， 置于 冰箱中 冷 冻保存 ，有效期 12 个月 ； 5)
8、20ng/mL 内标 标准 工作 溶 液： 移 取 0.1mg/mL 内 标标 准物质 储备 溶液 ， 用 甲醇 配制成 浓度 为 20ng/mL 的 内标 标准 工 作溶液 。密 封， 置于 冰箱 中冷藏 保存 ，有效期 3 个月 ； 6) 20ng/mL 质 控标 准工 作溶 液：分 别移取 氯 硝西 泮、 三唑仑 的 单一 标 准物质 工作 溶液 ， 用 甲醇 配制成 浓度 为 20ng/mL 的 质控 标准 工 作溶液 。 密封 ， 置 于冰 箱中 冷藏保 存 ， 有效 期 3 个 月。 5.2 材料 材料包 括： a) 具塞玻 璃试 管； b) 容量瓶 ； c) 不锈钢 医用 剪刀
9、。 6 仪 器和 设备 仪器和 设备 包括 ： a) 液相色 谱 串 联质 谱仪 ：配 电喷雾 离子 源 ； b) 电子分 析天 平： 实际 分度 值 d ； c) 离心机 ； d) 冷冻研 磨机 ； e) 振荡器 ； f) 超声波 清洗 器； g) 移液器 。 7 操 作方 法 7.1 定性 分析 7.1.1 样 品前 处理 7.1.1.1 检材 样品 制备 7.1.1.1.1 毛 发样 品洗 涤 GA/T 3 毛发样 品依 次用 适量 的水 和丙酮 分别 振荡 洗涤 各 次， 清洗 后的 毛发 晾干 后 剪成 约 段 。 或根 据毛发 样品 情况 和检 验目 的， 使 用不 锈钢 医用 剪
10、刀 对毛发 样品 进行 分段 处理 ， 再将 分段 后的 毛发 分别 处 理。 7.1.1.1.2 毛 发样 品粉 碎 将剪碎 的头 发段 装入 冷冻 研磨机 粉碎 。 7.1.1.1.3 样 品提 取 称取 研 磨后 的毛 发 粉末 份， 置于 玻 璃试管 中， 加入 值 的硼砂 缓冲 液 ， 超声 。 取 出后 加入 内标 标准工 作溶 液 ， 混匀 ， 再加 入 二 氯甲 烷， 振荡 ， 离 心 ， 移 取有 机层 在浓 缩器 上 下浓 缩至 干 。 残留物 加 入 乙腈 复 溶， 作为 检材 样品 提取 液， 供仪器 检测 。 7.1.1.2 质控 样品 制备 取等量 空白 毛发 样品
11、 两份 于玻璃 试管 中 ， 一 份作 为 空白样 品 ， 一 份添 加质 控 标准工作 溶 液 ， 使 其中 的 浓 度均 为20pg/mg ，作 为质控样品 ，与 检材 样 品平行 操 作， 得到 空白 样 品提取 液 和 质控 样 品提 取 液， 供仪器 检测 。 7.1.1.3 添加 样品 制备 若检材 样品中 出现 可疑苯 二氮 类药物 ， 取 空白毛 发样品 两份于 玻璃 试管中 ，一份 作为空 白样 品， 一份添 加检材 样 品中 出现 的可疑 苯二 氮 类药 物 单 一标准 工作 溶液 ， 作 为添 加样品 ， 与 检材 样品 平行 操 作，得 到空 白样 品提 取液 和添加
12、样品 提取 液， 供仪 器检测 。 7.1.2 仪 器检 测 7.1.2.1 液相 色谱- 串联 质谱条 件 以下为 参考 条件 ，可 根据 不同品 牌仪 器和 不同 样品 等实际 情况 进行 调整 ： a) 色谱柱 ：Allure PFP Propyl(2.1mm 100mm ， 液 相色谱 柱或 其 他 等效 柱。 注 ：Allure PFP Propyl 液相色谱 柱 为Restek 公司产品的商品名称， 给出这一信息是为了方便本标准的使用者， 并不是 表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 流动相 ：A ： 乙腈 ，B ：20mmol/L 乙酸
13、 胺和0.1% 甲 酸 缓冲液 ；洗 脱梯 度如 表1 所 示； 表1 梯 度洗 脱条 件 时间 流动相 流动相 c) 流速：0.2mL/min ； d) 柱温： （25 5 ） ； GA/T 4 e) 扫描方 式： 正离 子扫 描； f) 检测方 式： 多反 应监 测（MRM ）； g) 离子源 电压 ：5500V ； h) 碰撞气 （CAD ）、 气帘 气 （CUR ） 、雾 化气 （GS1 ）、辅 助气 （GS2 ）： 高 纯氮气 ； i) 去簇电 压（DP ） 、碰 撞能 量（CE ）、 质谱 定性 离子 对 、定 量离 子对 见表2。 表 2 质谱 定性 离子 对 、 定量离 子对
14、和去 簇电 压及 碰撞能量 条件 目标物 母离子 子离子 去簇电压 碰撞能量 地西泮 奥沙西泮 去甲西泮 替马西泮 氯硝西泮 氨基氯硝西泮 硝西泮 氨基硝西泮 氟硝西泮 氨基氟硝西泮 三唑仑 羟基三唑仑 阿普唑仑 羟基阿普唑仑 咪达唑仑 羟基咪达唑仑 艾司唑仑 GA/T 5 表2 质谱 定性 离子 对 、 定量离 子对 和去 簇电 压及 碰撞 能 量条 件 （ 续） 目标物 母离子 子离子 去簇电压 碰撞能量 氟西泮 地西泮 注： 为定量离子对 。 7.1.2.2 进样 分别吸 取空 白溶 剂、 质控 样品提 取液 、空 白样 品提 取液、 检材 样品 提取 液 、 添加样 品提 取液 ，按
15、仪器 条件 进样 检测 。 7.2 定 量分 析 7.2.1 样品 前处 理 取检材 样品， 按 照 、 进 行洗 涤和 粉碎 ， 称取粉 碎后 的检 材样 品 两 份 （若采 用内标 法 ， 则 在研 磨后 的 样品中 加入 内标 地西 泮 溶液 ） ， 按 进行 操 作得到 检材 样品 提取 液， 供仪器 检测 。 外标- 单点校正法：取 空白毛发样品，按照7.1.1.1.1 、7.1.1.1.2 进行洗涤和粉碎，取粉碎后的 等量 空 白样品 三份 ， 一份 作为 空 白样品 ， 另外 两份 添加 合 适浓度 的 、 检 材 样 品中 出 现的可 疑苯 二氮 类 药物 单 一标准 工作溶
16、液 ， 作为添 加样品 ，按 与检 材 平行操 作，得 到添 加样品 提取液 ，供仪 器检 测。 检 材样品 中目 标物 含量 应在 添加样 品中 目标 物含 量的 范围 内。 外标 校准曲线法：取 空白毛发样品，按照 、 进行洗涤和粉碎， 取粉碎后的等量 空 白样品 六份 ， 一份 作为 空 白样品 ， 另外 五份 添加 不 同浓度 的 、 检 材 样 品中 出 现的可 疑苯 二氮 类 药物 单 一标准 工作溶 液 （ 添加浓 度应呈 良好的 线性 关系， 且检材 样品中 目标 物的含 量应在 线性范 围内） ，作 为 添加样 品， 按 与 检 材样品 平行 操作 ，得 到添 加样品 提取
17、液， 供仪 器检 测。 内标 单点校正法： 取空白毛发样品，按照 、 进行洗涤和粉碎， 取粉碎后的等量 空 白样品三份 ，分别 加入等 量 内标 地西泮-D 5 溶液 ，一 份作为空白样品， 另外两 份添加合适浓度的 、检材 样品中 出现 的可 疑苯 二氮 类药 物单一 标准 工 作溶 液 ， 作 为添 加样 品， 按 与 检材 样品 平行 操作 ， 得到添 加样 品提 取液 ，供 仪器检 测。 检材 样品 中目 标物含 量应 在添加 样 品中 目标含 量的 范围 内。 内标 校准曲线法：取 空白毛发样品，按照7.1.1.1.1 、7.1.1.1.2 进行洗涤和粉碎，取粉碎后的等量 空 白样品
18、六份， 分别 加入等 量 内标 地西泮-D 5 溶液 ，一 份作为空白样品， 另外五 份添加不同浓度的 、检材 样品中 出现 的疑似 苯 二氮 类药 物单一 标准 工 作溶 液 （添 加浓 度应 呈良 好的 线性关 系， 且检 材样 品中 目 标物的 含量应 在线 性范围 内） ，作 为添 加样品 ，按 与检材 样品 平行操 作，得 到添加 样品 提取液 ， 供仪器 检测 。 7.2.2 仪 器检 测 7.2.2.1 仪器 条件 同 。 7.2.2.2 进样 GA/T 6 分别吸 取检 材样 品提 取液 、空白 样品 提取 液、 添加 样品提 取液 ， 按 仪 器条件 进样 分析 。 7.2.
19、3 计算 7.2.3.1 计算 含量 7.2.3.1.1 外标-校 准曲 线法 记 录 检 材样 品 提取 液 和添加 样 品 提取 液 中目 标 物的保 留 时 间和 峰 面积 值 ，以添 加 样 品提 取 液中 目 标物的 峰面 积的 平均 值为 纵坐标 、 添 加样 品提 取液 中 目标 物的 含量 为横 坐标 进行线 性回 归， 得到 线性 方 程。根 据检 材样 品提 取液 中目标 物的 峰面 积值 ，按 公式（1） 计算 出检 材样 品 中目标 物的 含量 。 a b y = . (1) 式中 ： 检 材样 品中 目标 物的 含量； y 检 材样 品提 取液 中目 标 物的峰 面积
20、 的平 均值 ； a 线性 方程 的斜 率 ； b 线 性方 程的 截距 。 7.2.3.1.2 外标-单 点校 正法 记录检 材样 品提 取液 和添 加样品 提取 液中 目标 物的 保留时 间和 峰面 积值 ，按 公式（2） 计算 检材 样 品中目 标物 的含量 。 = 式中： 检 材样 品中 目标 物的 含量； A 检 材样品 提取 液 中目标 物的 峰面 积 的 平均 值 ； A 添加 样品 提取 液 中目 标物 的峰 面积 的平 均值 ； 添加 样品 中目 标物的 含量 。 7.2.3.1.3 内标-校 准曲 线法 记 录 检 材样 品 提取 液 和添加 样 品 提取 液 中目 标 物
21、和内 标 的 保留 时 间和 峰 面积 值 ，以添加 样 品提 取 液中目标 物 与内 标 物的 峰面 积 比的 平 均值 为 纵坐 标、 添 加样 品 提取 液 中 目 标物 的 含量 为 横坐 标 进行 线 性回归 ，得到 线性 方程。 根据检 材样品 提取 液中目 标物及 内标的 峰面 积值， 按公式 （3） 计算出 检材 样 品中目 标物 的含量 。 a b y = . (3) 式中： 检 材样 品中 目标 物的 含量； y 检 材样 品提 取液 中目 标 物与内 标物 的峰 面积 比的 平均值 ； a 线 性方 程的 斜率 ； b 线 性方 程的 截距 。 7.2.3.1.4 内标-
22、单 点校 正法 记录检 材样 品提 取液 和添 加样品 提取 液中 目标 物和 内标的 保留 时间 和峰 面积 值，按 公式 （4 ）计 算 检材样 品中 目标 物的 含量 。 GA/T 7 = . (4) 式中： 检 材样 品中 目标 物的 含量； A 检 材样品 提取 液 中目标 物的 峰面 积 的 平均 值 ； A 添加 样品 提取 液 中目 标物 的峰 面积 的平 均值 ； Ai 检材 样品 提取 液 中内 标物 的峰 面积 的平 均值 ； Ai 添 加样 品 提 取液 中内 标物的 峰面 积 的 平均 值 ； 添 加样 品中 目标 物的 含量。 7.2.3.2 计算 相对 相差 记录
23、 中 计算 得到 的 检材样 品中 目标 物的 含量 ， 按公 式（ ） 计算 相对 相 差： 12 100% - RD= （ ） 式中 ： RD 相 对相 差， 用百 分比 （ ） 表示 ； 、 两份 检材 样品 中 目标物 的含 量； 两 份检 材样 品中 目标 物 含量的 平均 值。 8 分 析结 果评 价 8.1 定性 结果 评价 8.1.1 阳 性结 果评 价 在相同 条件 下进 行样 品测 定时， 检材 样品 中目 标物 的色谱 峰保 留时 间与 添加 样品 一 致 （ 相对 误差 在 之 内） 、 目标 物的 两 对离子 对与 添加 样品 一致 ， 且 离子 对丰度 比与 浓度
24、接近的 添加 样品 相比 ， 相 对 误差不 超过 表 规定 的范 围，空 白样 品无 干扰 ，则 可判断 检材 样品 中检 出目 标物。 表 3 离子 对丰 度比 的最 大 允许相 对 误 差范 围 离子对丰度比 50% 2050 10 20 最大允许相对 误差 20 25 30% 50% 8.1.2 阴 性结 果评 价 检材样 品 中未 出现 苯二氮 类药 物 的色 谱峰 ，质控 样品中 出现与 氯硝 西泮、 三唑仑 一致的 色谱 峰， 空白样 品无 干扰 ，则 可判 断检材 样品 中未 检出 目标 物。 8.2 定量 结果 评价 如果检 材样 品中 目标 物含 量的RD ， 定量 数据
25、可 靠， 其 质量 分数 按两 份检 材的平 均值 计算 。 如 果检材 样品 中目 标物 含量 的RD ， 定量 数据 不 可靠， 应按 重新 提取 检 验。 方法学 相关 实验 数据 参见 附录 ， 相关 谱图 参见 附录 。 A GA/T 8 附 录 A （资料 性 ） 化合物 基本 信息 地西泮 等 种 苯二 氮 类 药物的 基本 信息 见 表 A.1 。 表A.1 地 西泮 等 18 种 苯 二氮 类药 物的 基本 信息 编号 药物名称 英文名称 分子式 分子量 编号 1 地西泮 2 奥沙西泮 3 去甲西泮 4 替马西泮 5 氯硝西泮 6 氨基氯硝西泮 7 硝西泮 8 氨基硝西泮 9
26、 氟硝西泮 10 氨基氟硝西泮 11 三唑仑 12 羟基三唑仑 13 阿普唑仑 14 羟基阿普唑仑 15 咪达唑仑 16 羟基咪达唑仑 17 艾司唑仑 18 氟西泮 GA/T 9 附 录 B （资料 性） 方法学 相关 数据 B.1 方法 检出 限、 定量 下 限和 工 作曲 线 毛发中 苯二 氮 类药 物分 析的 检 出限 、定 量下 限、 线性方 程 和 线性 范围 见表 。 表B.1 检 出限 、定 量下 限、 线 性方 程和 线性 范围 目标物 线性范围 线性方程 相关系数 检出限 定量下限 地西泮 奥沙西泮 去甲西泮 替马西泮 氯硝西泮 氨基氯硝西泮 硝西泮 氨基硝西泮 氟硝西泮 氨
27、基氟硝西泮 三唑仑 羟基三唑仑 阿普唑仑 羟基阿普唑仑 咪达唑仑 羟基咪达唑仑 艾司唑仑 氟西泮 方法 准确 度、 精密 度 毛发中 苯二 氮 类药 物分 析的方 法准 确度 、精 密度 数据见 表 。 GA/T 10 表B.2 毛 发中 苯二 氮 类药物 测定 的精 密度 和准 确度 目标物 添加浓度 准确度 回收率 基质效应 精密度 日内 日间 地西泮 奥沙西泮 去甲西泮 替马西泮 硝西泮 氨基硝西泮 氟硝西泮 氨基氟硝西泮 氯硝西泮 氨基氯硝西泮 氟西泮 阿普唑仑 GA/T 11 表 B.2 毛 发中 苯二 氮 类药物 测定 的精 密度 和准 确度 （ 续） 目标物 添加浓度 准确度 回
28、收率 基质效应 精密度 日内 日间 羟基阿普唑仑 三唑仑 羟基三唑仑 咪达唑仑 羟基咪达唑仑 艾司唑仑 GA/T 12 附 录 C （资料 性） 相关谱 图 毛发中 苯二 氮 类药 物 的 色谱 图见 图 图 。 图C.1 空 白头 发 MRM 总 离子流 色谱 图 图C.2 空 白头 发中 添加20pg/mg 苯 二氮 类 药物 MRM 总离 子 流 色谱 图 GA/T 13 a ）地西泮 b ）奥沙西泮 c ）去甲西泮 d ）替马西泮 f ）7- 氨基氯硝西泮 g ）硝西泮 i ）氟硝西泮 j ）7- 氨基氟硝 西泮 e ）氯硝西泮 h ）7- 氨基硝西泮 k ）三唑仑 l ）- 羟基三唑仑 m ）阿普唑仑 n ） - 羟基阿普唑仑 o ）咪达唑仑 p ） - 羟基咪哒唑仑 q ）艾司唑仑 r ）氟西泮 图 C.3 空白头发中添加 20pg/mg 苯二 氮 类药 物 各 化合 物 MRM 色谱图
