1、IC骂67.040C 53 中华人民共和国国家标准GB/T 5009.192一2003动物性食品中克伦特罗残留量的测定2003-08-11发布Determination of 4-amino-3 , 5-dichloro户( tert-butylamino) methyl-benzyl alcohol (c1enbuterol) residues in animal foods 2004-01响。1实施归。中华人民共和国卫生变发布中国国家标准化管理委员再GB/T 59.192-2003 前言本标准修改采用了EUR15127-EN兽药残留，动毒草位食品及很I在一一-参考物质和分析方法，2ndEd
2、 ,Sg2. LCg2. 3、Sg2.4和Cy2.3欧盟兽药残留方法g动物性食品中兽药残留的测定方法以1994年英文第二版)。本标准与欧盟动物性食品中兽药残留部测定方法)Sg2.1、Sg2.3、Sg2. 4和Cy2.3不同之处为2-Sg21、Sg2.3,Sg 2.4和Cy2.3为动物性食品中F兴奋剂的多级分残留捡事革方法，本标准仅提出动物性食品中克伦特罗单一组分更是爵的检测方法。一Sg2.1为牛尿液中F兴奋剂的GC-MS筛选方法，Sg2.3为牛尿液中-兴奋剂的ELISA筛选方法，Sg2. 4为牛肝、肾和肉中萨兴奋剂的GC-MS筛选方法，Cy2.3为牛尿液中-兴奋剂的GC-MS磁波方法。本标准则
3、提出从董事联免疫法(ELISA)筛选、离效滚裙色滋法CHPLC)j逢到j气质联执法(GC-MSl确证和定量的一套方法，以满足我隐动物性食品中究伦特罗残留挂在控的需要。一本标准中酶联免疫法(ELISA)筛选和气质联机法(GC-MS)的测定原理、操作过程和要求、.:要技术参数及梭满灵敏度与欲望方法一致。本标准中的高效液相色谱法(HPLC)是根据实验资料及验证童在柴提出的e本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位:中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所、中国肉类食品综合研究中心、北京市疾病预防控制中心。本标准主要起草人s美永宁、苦虹、赵云峰、赵京玲、赵榕、吴屈华、:E凌渎。521 GB
4、/T 5009. 192-2003 引言克伦特罗，为强效选择性自2受体激动剂，有强而持久的松弛支气管平滑肌的作用，用于治疗哮喘。克伦特罗可促进动物生长，改善动物体内脂肪分配，并增加瘦肉率。20世纪90年代，我国错误地将其作为科研成果开始以饲料添加剂引入并推广，被俗称为瘦肉精气一连串因食用含克伦特罗的食物而引起的中毒事件发生后，使克伦特罗成了世界上普遍禁用的饲料添加剂。1997年以来，我国有关行政部门多次明令禁止畜牧行业生产、销售和使用盐酸克伦特罗。但我国各地克伦特罗中毒事件仍然频繁发生，说明非法使用克伦特罗现象依然存在。为了对畜禽产品中的克伦特罗开展监测，加强市场监督检验力度，预防中毒事件的发
5、生，必须建立有效的检测方法。我国在这方面的检测工作起步较晚，伴随着国际和国内对克伦特罗的禁用和监控要求，迫切需要发展适合我国国情的从筛选到确证的一套检测方法。为此，本标准提出了从酶联免疫法(ELlSA)筛选、高效液相色谱法(HPLCl定量到气质联机法(GC-MS)确证和定量这一套方法来满足我国动物性食品中克伦特罗残留监控的需要。522 GB/T 5009. 192-2003 动物性食晶中克伦特罗残留量的测定1 范围本标准规定了动物性食品中克伦特罗的测定方法。本标准适用于新鲜或冷冻的畜、禽肉与内脏及其制品中克伦特罗残留的测定。本标准也适用于生物材料(人或动物血液、尿液)中克伦特罗的测定。本方法检
6、出限z第一法气相色谱质谱法为0.5月/kg;第二法高效液相色谱法为0.5I-g/kg;第三法酶联免疫法为0.5g/kg，线性范围=第一法气相色谱质谱法为O.025 ng2. 5吨，第二法高效液相色谱法为O.5 ng4 ng;第三法酶联免疫法为O.004 ngO. 054吨。第一法气相色谱-质谱法(GC-MS)2 原理固体试样剪碎，用高氯酸溶液匀浆。液体试样加入高氯酸溶液，进行超声加热提取，用异丙醇+乙酸乙醋(40十60)萃取，有机相浓缩，经弱阳离子交换柱进行分离，用乙醇+浓氨水(98+2)溶液洗脱，洗脱液浓缩，经N，O-双三甲基硅烧三氟乙酸胶(BSTFA)衍生后于气质联用仪上进行测定。以美托洛
7、尔为内标，定量。3 试剂3.1 克伦特罗(clenbuterolhydrochloride)，纯度二三99.5%。3.2 美托洛尔(metopro10 1) ，纯度;?99%。3.3 磷酸二氢俐。3.4 氢氧化锅。3.5 氯化锅。3.6 高氯酸。3.7 浓氨水。3.8 异丙醇。3.9 乙酸乙醋.3.10 甲醇:HPLC级。3.11 甲苯2色谱纯。3.12 乙醇。3.13 衍生弗IJ:N，O-双三甲基硅烧三氟乙酷胶(BSTFA)。3.14 高氯酸溶液(0.1mol/L)。3.15 氢氧化铺溶液。mol!L)。3.16 磷酸二氢销缓冲液(0.1mol/L , pH=6. 0) , 3.17 异丙醇
8、十乙酸乙酶(40十60)。3.18 乙醇十浓氨水(98+2)。3.19 美托洛尔内标标准溶液g准确称取美托洛尔标准品，用甲醇溶解配成浓度为240mg/L的内标储备液，贮子冰箱中，使用时用甲酶稀释成2.4mg/L的内标使用液。3.20 克伦特罗标准溶液g准确称取克伦特罗标准品，用甲醇溶解配成浓度为250mg/L的标准储备液，贮于冰箱中，使用时用甲蹲稀释成0.5mg/L的克伦特罗标准使用液。523 GB/T 5009. 192-2003 3.21 弱阳离子交换柱(LC-WCXH3mL)。3.22 针筒式微孔过滤膜(0.45m，水相)。4 仪器4.1 气相色谱-质谱联用仪(GC/MS)。4.2 磨口
9、玻璃离心管，1l.5 cm(长)X3. 5 cm(内径)，具塞。4.3 5 mL玻璃离心管。4.4 超声波清洗器。4.5 酸度计。4.6 离心机。4.7 振荡器。4.8 旋转蒸发器。4.9 涡撞在式混合器。4.10 恒温加热器。4.11 N2蒸发器。4.12 匀浆器。5 分析步骤5.1 提取5. 1. 1 肌肉、肝脏、肾脏试样称取肌肉、肝脏或肾脏试祥10g(精确到0.01斜，用20mL O. 1 mol/L高氯酸溶液匀浆，置于磨口玻璃离心管中9然后置于超声波清洗器中超声20min，取出置于80C水浴中加热30min，取出冷却后离心(4500r/min) 15 min。倾出上清液，沉淀用5mL
10、O. 1 mol/L高氯酸溶液洗涤，再离心，将两次的上清液合并。用1mol/L氢氧化纳溶液调pH值至9.5土0.1，若有沉淀产生，再离心(4500 r/min) 10 min，将上清液转移至磨口玻璃离心管中，加入8g氯化销，混匀，加入25mL异丙醇+乙酸乙醋(40十60)，置于振荡器上振荡提取20min。提取完毕，放置5min(若有乳化层稍离心一下)。用吸管小心将上层有机相移至旋转蒸发瓶中，用20mL异丙醇+乙酸乙醋(40十60)再重复萃取一次，合并有机相，于60C在旋转蒸发器上浓缩至近干。用1mL O. 1 mol/L磷酸二氢销缓冲液(pH6.0)充分溶解残留物，经针筒式微孔过滤膜过滤，洗涤
11、三次后完全转移至5mL玻璃离心管中，并用0.1mol/L磷酸二氢销缓冲液(pH6.0)定容至刻度。5.1.2 尿液试样用移液管量取尿液5mL，加入20mL O. 1 mol/L高氯酸溶液，超声20min混匀。置于80C水浴中加热30min。以下按5.l. 1从用1mol/L氢氧化锅溶液调pH值至9.5士0.1起开始操作.5. 1. 3 血液试样将血液于4500 r/min离心，用移液管量取上层血清1mL置于5mL玻璃离心管中，加入2mL 0.1 mol/L高氯酸溶液，混匀，置于超声波清洗器中超声20min，取出置于80C水浴中加热30min，取出冷却后离心(4500 r/min)l5 min,
12、 I1罚出上清液，沉淀用1mL O. 1 mol/L高氯酸溶液洗涤，离心(4500 r/min) 10 min，合并上清液，再重复一遍洗涤步骤，合并上清液。向上清液中加入约1g氯化销，加入2mL异丙醇+乙酸乙醋(40十60)，在涡植在式混合器上振荡萃取5min，放置5min(若有乳化层稍离心一下)，小心移出有机相于5mL玻璃离心管中，按以上萃取步骤重复萃取两次，合并有机相。将有机相在N2-浓缩器上吹干。用1mL O. 1 mol/L磷酸二氢销缓冲液(pH6.0)充分溶解残留物，经筒式微孔过滤膜过滤完全转移至5 mL玻璃离心管中，并用。1mol/L磷酸二氢铺缓冲液(pH6.0)定容至刻度。5.2
13、 净化依次用10mL乙醇、3mL水、3mL O. 1 mol/L磷酸二氢销缓冲液(pH6.0) , 3 mL水冲洗弱阳离子交换柱，取适量5.l. 1、5.l. 2和5.l. 3的提取液至弱阳离子交换柱上，弃去流出液，分别用4mL水和524 GB/T 5009. 192-2003 4 mL乙醇冲洗柱子，弃去流出液，用6mL乙薛+浓氨水(98+2)冲洗柱子，收集流出液。将流出液在N2蒸发器上浓缩至干。5.3 衍生化于净化、吹干的试样残渣中加入100L500L甲醇，50L2. 4 mg/L的内标工作液，在风蒸发器上浓缩至干，迅速加入40L衍生剂(BSTFA)，盖紧塞子，在涡游式混合器上混匀1min，
14、置于75C的恒温加热器中衍生90mino衍生反应完成后取出冷却至室温，在涡被式混合器上混匀30s，置于N，蒸发器上浓缩至干。加人200L甲苯，在涡挂在式混合器上充分混匀，待气质联用仪进样。同时用克伦特罗标准使用液做系列同步衍生.5.4 气相色谱-质谱法测定5.4.1 气相色清质谱法测定，戴设定气相色谱柱:DB-5MS柱，30mXO. 25 mmXO. 25mo 载气:He，柱前压:8psi。进样口温度:240C。进样量:1L，不分流。柱温程序:70C保持1min，以18C/min速度升至200C，以5C/min的速度再升至2450C，再以25C/min升至280C并保持2mioo EI源电子轰
15、击能:70eV。离子源温度:200C0 接口温度:285C。溶剂延迟:12min。EI源检测特征质谱峰g克伦特罗:m/z86、187、243、262;美托洛尔:m/z72、22305.4.2 测定吸取1L衍生的试样液或标准液注入气质联用仪中，以试样峰(m/z86 , 187 , 243 , 262 , 264 , 277 , 333)与内标峰(m/z72，223)的相对保留时间定性，要求试样峰中至少有3对选择离子相对强度(与基峰的比例)不超过标准相应选择离子相对强度平均值的士20%或3倍标准差。以试样峰(m/z86)与内标峰(m/z72)的峰面秧比单点或多点校准定量。5.4.3 克伦特罗标准与
16、内标衍生后的选择性离子的总离子流困及质谱闺见图1图30100 可Oenbuterol(m/Z脯.187，243.262.264.271，333%舌，飞1胁prolol仁;二:100司enbuteroll m/z 86 %才R。U M U U 圈1克伦特罗与内标衍生物的选择性离子总离子流圄t/min 525 GB/T 500轧192-2003盹2盹% 333 mh 100 120 140 160 1回200220 240 260 280 3怕320副2克伦特罗衍生物的法捺离子质谱图12 1 % 223 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 2
17、00 210 220 回3内标衍生物的选搪陶子质谱图5.5 结果计算按内标法单点草草多点校准计算试样中克伦特罗的含最岱Jl!.式(1)，式中zx=生三i贷Zm; X一一试样叫拉克伦特罗的含量，单位为徽克每千克或徽克每升)严g/kg(或问IL门zA一一试样色谱蜂与内标色谱峰的峰面积比值对应的:ll伦特罗质量，单位为纳克(ng)，f一一试样稀释倍数sm一试样的取样量，单位为克(或毫升)g(或mL)J.计算纷泉适量涂到小数点后两位，6 精密度在蠢篆蚀条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得越过算术平均值的20%。第二法富效渡根色攒法(HPLC)7累理.( 1 ) 题体试串羊剪善事.J音高l!.酸溶
18、液匀浆，滚体试样主器人离氯酸溶泼，送行超声加热提取后，用异fI董事十乙酸乙黯+60)黎浓，有机榕浓缩，经弱陆离子交换校进行分离，用乙董事十氨(98+2)溶液浅麟，洗贱液经浓缩，流动相定容后在高效液相色谱仪上进行测定，外标法定量.8 试f略与材料8.1 3在伦特罗(clenbuterolhydrochloride)，纯度:;99.5%。8.2 磷酸二氢锅。在3氮氧化销。8.4 靠在化钧。8.5 商氯酸。8.6 浓氮水。8. 7 季两董事。8.8 乙盖章乙襟。8.9 甲醇:HPLC级思8.10 乙醉。8.11 商氯酸溶液(0.1mol!Llo 8.12 氮氧化镇滚滚(lmol/L). 8.13 磷
19、酸二氢销缓冲液(0.1mol!L , pH=6. 0). 8.14 异丙醇+乙酸乙麟(40+60)。8.15 乙醉+浓氨水(98十2)。8.16 !jlll事十水(45十55)。GB/T 5009.192-2003 8.17 11.:伦特罗标准溶液的配审:准确称草草克伦特罗标准品房!jl醇配成浓度为250mg/L的标准储备液，贮子冰箱中g使用时用甲醇稀释成0.5mg/L的克伦特罗标准使用液，进一步用甲醇+水(45+55)适当稀释。8. 18 :母Ila离子交换校(LC-WCX)(3mL)。2 仪楼9.1 水裕起声清洗器。9.2 腾口玻璃离心管:11.5cm(长)X3.5cm(内径)，具塞。立3
20、5 mL玻璃离心镑。9.4 酸度计。9.5 离心机。9.6 振荡器。9.7 旋转蒸发器，9.8 涡被式混合器。9.9 针筒式微孔过滤膜(0.45m，水相).9.10 N，-蒸发器。9.11 匀浆器，9.12 董事效液招色道仪。10 分析步骤10.1 搬取10. 1. 1 戴沟、野疆、海撞在这样向5.1.10 10.1.2 尿液试样同5.1.2.527 GB/T 5009.192-2003 10. 1. 3 血液试样同5.1.3.10.2 净化同5.2。10.3 试样测定前的准备于净化、吹干的试样残渣中加入100L500L流动相，在涡游式混合器上充分振摇，使残渣溶解，液体浑浊时用。.45m的针筒
21、式微孔过滤膜过滤，上清液待进行液相色谱测定。10.4 测定10.4.1 液徊色谱测定参考条件色谱柱:BDS或ODS柱.250mmX4. 6 mm.5m。流动相2甲醇+水(45+5日。流速:1mL/min. 进样量:20L50L.柱箱温度:25C。紫外检测器:244nm. 10.4.2 测定吸取20L50L标准校正溶液及试样液注人液相色谱仪，以保留时间定性，用外标法单点或多点校准法定量。10.4.3 克伦特罗标准的液相色谱固见图4。Clenbuterol 回4克伦特罗标准(100ILg!L)的高效渡相色谱固10.5 结果计算按外标法计算试样中克伦特罗的含量。见式(2): 式中zx=生兰iz 6
22、tlmin X试样中克伦特罗的含量，单位为微克每千克(或微克每升)g/kg(或g/L)J;A 试样色谱峰与标准色谱峰的峰面积比值对应的克伦特罗的质量，单位为纳克(ng);f一一试样稀释倍数;m 试样的取样量，单位为克(或毫升)g(或mL)J。计算结果表示到小数点后两位。11 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。528 .( 2 ) GB/T 5009. 192-2003 第三法酶联免瘦法(ELISA筛选法)12 Ji重建基于抗原抗体反应进行竞争性抑制测定。微孔板包被有针对克伦特罗IgG的包被抗体。克伦特罗抗体被加入，经过孵育及洗涤步骤后，加入竞争性爵
23、标记物、标准或试祥溶液。克伦特J)与竞争饺德标记物竞争克伦特罗抗体，没有与抗体连接的克伦特J)标记酶在洗涤步蝶中被除去。将底物(过氧化尿素牵挂发色1fiJ(JIY审基联苯黯加入到j孔中孵臂，结合的标记德将无色的发色刻转化为蓝色的产物加入反应停止液后使颜色由ii转变为黄色。在450nm处测量吸光度值，吸光度比僚与克伦特罗浓度的自然对数成反比。13试剂13.1 磷酸二氢销。13.2 离氯酸。13.3 异丙醇。13.4 乙酸乙惑。13: 5 商氯酸溶液(0.1mol/口。13.6 氮氧化纳溶液(1mol!L)。13.7 磷酸二氨锵缓冲液(0.1mollL，pH贺礼。).13.8 异丙醇+乙酸乙酣(4
24、0+60)。13.9 针揭式徽孔过滤蹊号.45m，水相。13.10 克伦特罗酶联免疫试剂盒。13.10.1 96孔饭(12条X8孔)包被有针对克伦特罗IgG的包被抗抗体。13.10.2 克伦特罗系列标准液至少有5个倍比稀释浓度水平，外加1个空白。13.10.3 过氧化物酶标记物(浓缩液) 13.10.4 克伦特罗抗体浓缩滚儿13.10.5 酶底物2过氧化尿素。13.10.6 发色1fiJ，囚甲暴联苯胶。13.10.7 反应停止液，1mol/L硫破。13.10.8 缓冲液z酶标记物及抗体浓缩液稀释用.14 仪辈辈14于1超声波清洗器。14.2磨口玻璃离心管，11.5cm(长)X3.5cm(内径)
25、，具塞。14.3 酸度计。14.4 离心机。14.5 振荡器，14.6 旋转蒸发器。14.7 涡滋式混合器e14.8 匀浆器。14.9 德标仪(配备450nm滤光片)。14.10微量移液器s单退却严L、50L、100L和多道50严L-250Li耳源。529 G/T 5009. 192-2003 15 试样测定15.1 提取15. 1. 1 肌肉、肝脏及肾脏试样同5.1.1, 15. 1. 2 尿液试样者尿液浑浊先离心(3000r/min)10 min，将上清液适当稀释后上酶标板进行酶联免疫法筛选实验.15. 1. 3 血液试样将血清或血浆离心(3000 r/min) 10 min，取血清适当稀
26、释后上酶标板进行酶联免疫法筛选实验。15.2 测定15.2.1 试剂的准备15.2.1.1 竞争酶标记物提供的竞争酶标记物为浓缩液。由于稀释的酶标记物稳定性不好，仅稀释实际需用量的酶标记物。在吸取浓缩液之前，要仔细振摇。用缓冲液以1: 10的比例稀释酶标记物浓缩液(如400L浓缩液+4.0 mL缓冲液，足够4个微孔板条32孔用)。15.2. 1. 2 克伦特罗抗体提供的克伦特罗抗体为浓缩液，由于稀释的克伦特罗抗体稳定性变差，仅稀释实际需用量的克伦特罗抗体。在吸取浓缩液之前，要仔细振摇。用缓冲液以1: 10的比例稀释抗体浓缩液(如400L浓缩液+4.0mL缓冲液，足够4个微孔板条32孔用)。15
27、.2. 1. 3 包被有抗抗体的微孔极条将锡?自袋沿横向边压皱外沿剪开，取出需用数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放进原锡街袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2C8C。15.2.2 试样准备将10.1的提取物取20L进行分析。高残留的试样用蒸馆水进一步稀释。15.2.3 测定使用前将试剂盒在室温(l9C25C)下放置1h2 h。15.2.3.1 将标准和试样(至少按双平行实验计算)所用数量的孔条插入微孔架，记录标准和试样的位置。15.2.3.2 加入100L稀释后的抗体溶液到每一个微孔中。充分混合并在室温孵育15min , 15.2.3.3 倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打每
28、行拍打3次)以保证完全除去孔中的液体.用250L蒸馆水充人孔中，再次倒掉微孔中液体，再重复操作两遍以上。15.2.3.4 加入20L的标准或处理好的试样到各自的微孔中。标准和试样至少做两个平行实验。15.2.3.5 加入100L稀释的酶标记物，室温孵育30min, 15.2.3.6 倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打(每行拍打3次)以保证完全除去孔中的液体。用250L蒸馆水充人孔中，再次倒掉微孔中液体，再重复操作两次以上。15.2.3.7 加人50L酶底物和50L发色试剂到微孔中，充分混合并在室温暗处孵育15min, 15.2.3.8 加人100L反应停止液到微孔中。混合好尽快在450
29、nm波长处测量吸光度值。15.3 结果计算用所获得的标准溶液和试祥溶液吸光度值与空白溶液的比值进行计算。见式(3): 相对吸光度值(%)= B/Bo X 100 .( 3 ) 式中=B 标准(或试样)溶液的吸光度值PBo 空白(浓度为0的标准溶液)的吸光度值。530 GB/T 5009. 192-2003 将计算的相对吸光度值(%)对应克伦特罗浓度(ng/L)的自然对数作半对数坐标系统曲线图，校正曲线在0.004ng-O. 054 ng(200 ng/L-2 000 ng/L范围内)呈线性，对应的试样浓度可从校正曲线算出。见式(4): -Anu -4，AU 一A一-m x . ( 4 ) 式中zX一一试样中克伦特罗的含量，单位为微克每千克(或微克每升)g/kg(或g/L)，A一一试样的相对吸光度值(%)对应的克伦特罗含量，单位为纳克每升(ng/L), f 试样稀释倍数Pm 试样的取样量，单位为克(或毫升)g(或mL)。计算结果表示到小数点后两位。阳性结果需要经过第一法确证.16 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。531
