1、ICS 67050X 04 a雪中华人民共和国国家标准GBT 22944-2008蜂蜜中克伦特罗残留量的测定20081231发布液相色谱一串联质谱法Determination of clenbuterol residues in honeyLCMSMS method20090501实施宰瞀徽鬻瓣警糌瞥星发布中国国家标准化管理委员会徼1”刖 吾本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局。本标准主要起草人：曹彦忠、石玉秋、贾光群、姚智慧、刘晓茂、庞国芳。GBT 22944-20081范围蜂蜜中克伦特罗残留量的
2、测定液相色谱一串联质谱法本标准规定了蜂蜜中克伦特罗残留量液相色谱一串联质谱测定方法。本标准适用于蜂蜜中克伦特罗残留量的测定。本标准的方法检出限为1 pgkg。2规范性引用文件GBT 22944-2008下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 63791 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第l部分：总则与定义(GBT 63791 2004，ISO 5725 1：1994
3、，IDT)GBT 63792测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GBT 637922004，Is0 57252：1994，IDT)GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682 2008，IsO 3696：1987，MOD)3原理蜂蜜中残留的克伦特罗用乙酸钠缓冲溶液(pH=：5o)提取，过滤后，经Oasis HLB”或相当的固相萃取柱净化，用氨水甲醇溶液洗脱并蒸干，残渣用甲醇一01甲酸溶液溶解，过02 bcm滤膜后，样品溶液供液相色谱一串联质谱仪测定，内标法定量。4试剂和材料41水：GBT 6682，一级。42甲醇：色谱
4、纯。43乙腈：色谱纯。44乙酸钠：优级纯。45冰乙酸：优级纯。46氨水：分析纯。47甲酸：优级纯。48 02molL乙酸钠缓冲溶液：称取164 g乙酸钠(44)，放人1 000mL烧杯中，加入800mL水溶解，用冰乙酸(45)调至pH值为50，再用水定容至1 000 mL。49氨水一甲醇溶液(1+19)：吸取5 mL氨水(46)与95 mL甲醇(42)混合均匀。410 甲醇溶液(3+7)：量取30 mL甲醇与70 mL水混合均匀。411 01甲酸溶液：吸取10 mL甲酸(47)，用水稀释至l 000 mL。412甲醇一0I甲酸溶液(1+19)。量取5 mL甲醇与95 mL 01甲酸溶液(411
5、)混合。413克伦特罗标准物质(CAS 37148279)：纯度95。1)0螂i HLB固相萃取柱是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 1GBT 22944-2008414 10mgmL标准储备溶液：准确称取适量的克伦特罗标准物质(413)，用甲醇配成l_0mgmL的标准储备溶液。该溶液在4保存。415 10 pgmL标准工作溶液：吸取01 mL标准储备溶液(414)放人100 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。该溶液在4保存。416内标物质：克伦特罗一D9，纯度99。417 10
6、 mgraL内标储备溶液：准确称取适量克伦特罗一D9标准物质(416)，用甲醇配成10 mgmL内标贮备溶液。该溶液于CC保存。418 10 pgmL内标工作溶液：吸取01 mL内标储备溶液(417)放人100 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。该溶液在4保存。419基质标准工作溶液：吸取不同体积标准工作溶液(415)和20 pL内标工作溶液(418)，用空白样品提取液配成10 ngmL、20 ngmL、50 ngmL、100 ngmL、500 ngmL不同浓度的基质标准工作溶液。当天配制。420 Oasis HLB固相萃取柱或相当者：500 mg，6 mL。用前依次用6 mL甲醇和10 mL水
7、活化。保持柱体湿润。421滤膜：02 p-m。5仪器51液相色谱一串联质谱仪：配有电喷雾离子源。52固相萃取装置。53氮气浓缩仪。54液体混匀器。55分析天平：感量01 mg，001 g。56真空泵：最大负压80 kPa。57 pH计：测量精度土002。58玻璃贮液器：50 mL。59吹干管：10 mL。6试样制备与保存61试样的制备对无结晶的实验室样品，将其搅拌均匀。对有结晶的样品，在密闭情况下，置于不超过60的水浴中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，冷却至室温。分出05 kg作为试样。制备好的试样置于样品瓶中，密封，并做上标记。62试样的保存将试样于常温下保存。7测定步骤71提取称取2 g
8、试样，精确至001 g。置于150 mL三角瓶中，加入20 mL乙酸钠缓冲溶液(48)，加入20 pL内标工作溶液(418)，于液体混匀器(54)上快速混匀1 min，使试样完全溶解。72净化将塞有玻璃棉的玻璃贮液器(58)连到Oasis HLB或相当的固相萃取柱(420)上，把样液倒人玻璃贮液器中，调节流速小于3 mLmin，使样液通过Oasis HLB固相萃取柱，待样液完全流出后，依次用5 mL水和5mL甲醇溶液(410)洗柱，弃去全部流出液。固相萃取柱减压抽干30min，然后用5mL氨2GBT 22944-2008水一甲醇溶液(49)洗脱，收集洗脱液于10 mL吹干管(59)中。在50。
9、C水浴用氮气浓缩仪吹干。准确加入10 mL甲醇一01甲酸溶液(412)溶解残渣，过02 pm滤膜后，供液相色谱一串联质谱仪测定。按上述操作步骤，制备用于配制系列基质标准工作溶液的空白样品提取液。73测定条件731液相色谱参考条件a)色谱柱：Atlantis C3 pm，150 mm21 ram(内径)或相当者；b)柱温：40。C；c)流速；02 mL；d)进样量：20“L；e) 流动相：A：乙腈，B：01甲酸水溶液，梯度洗脱条件见表1。表1梯度洗脱条件时间min A B0 00 50 95 0800 800 200801 50 95 O1100 50 950732质谱参考条件a)离子源：电喷雾
10、离子源；b)扫描方式：正离子扫描；c)检测方式：多反应监测；d)电喷雾电压：5 500 V；e)雾化气压力：0083 MPa；f)气帘气压力：0069 MPa；g)辅助气流速：6 Lmin；h)离子源温度：500；i)定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压见表2。表2定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压定性离子对 定量离子对 碰撞气能量 去簇电压化台物中文名称 化合物英文名称(mz) (m止) V V277203 20克伦特罗 clenbuterol 277203 20277259 1474液相色谱串联质谱测定741定性测定被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同的试验条件
11、下，样品中待测物质的保留时间与标准溶液中对应的保留时间偏差在25之内；且样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的标准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表3规定的范围，则可判定样品中存在对应的待测物。表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 以表示相对离子丰度K K50 20K50 10K20 K10允许最大偏差 土20 士25 士30 士50GBT 22944-2008742定量测定在仪器的最佳工作条件下，用基质标准工作溶液(419)分别进样，以各标准溶液中被测组分峰面积与内标物峰面积的比值为纵坐标，以各标准溶液被测组分浓度与内标物浓度的比值为横坐标，绘制标准工作曲线。用标
12、准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中克伦特罗的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件和质谱条件下，克伦特罗的参考保留时问为246 rain。克伦特罗的标准物质多反应监测(MRM)色谱图参见附录A中的图A1。本方法中克伦特罗添加浓度及其平均回收率的试验数据参见附录B中的表B1。75平行试验按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。76空白试验除不称取样品外，均按上述步骤进行。8结果计算蜂蜜中克伦特罗残留量的测定结果按式(1)计算。x一会三含筹舞式中：x试样中被测物残留量，单位为微克每千克(1-gkg)；c。一基质标准工作溶液中被测物的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；A一一试样溶液中被
13、测物的色谱峰面积；A。基质标准工作溶液中被测物的色谱峰面积；Ci试样溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；矗基质标准工作溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；A。基质标准工作溶液中内标物的色谱峰面积；A试样溶液中内标物的色谱峰面积；V样液最终定容体积，单位为毫升(mL)；m一一试样溶液所代表试样的质量，单位为克(g)。计算结果应扣除空白值。9精密度9。1一般规定本标准的精密度数据是按照GBT 63791和GBT 63792的规定确定的，其重复性和再现性的值是以95的可信度来计算。92重复性在重复性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，蜂蜜中克伦特
14、罗添加浓度范围及重复性方程见表4。表4 添加浓度范围及重复性和再现性方程 单位为微克每千克l 化合物名称 添加浓度范围 重复性限r 再现性限Rl 克伦特罗 1 0500 lgr=0780 1 19m 1047 8 IgR一0665 5 lgm一0753 5I 注：m为两次测定值的算术平均值。如果差值超过重复性限r，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。93再现性在再现性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，蜂蜜中克伦特罗的添加浓度范围及再现性方程见表4。4附录A(资料性附录)标准物质多反应监测(MRM)色谱图克伦特罗标准物质多反应监测(MRM)色谱图见图A1。响6 oe4值5 oe4图A1 克伦特罗标准物质多反应监测(MRM)色谱图附录B(资料性附录)回收率本方法中克伦特罗添加浓度及其平均回收率的试验数据见表B1。表B1 克伦特罗添加浓度及其平均回收率的试验数据GBT 22944-2008化合物名称 添加浓度(pgkg) 平均回收率10 90 650 971克伦特罗100 96750o 1026；1
