1、ICS 67.040 C 53 中华人民共和国国家标准食c 口口GB/T 5009.83一2003代替GB/T12389一1990中胡萝卡素的测定Determination of carotene in foods 2003-08-11发布2004-01-01实施中华人民共和国卫生变发布中国国家标准化管理委员再GBjT 5009.83-2003 . 目。言本标准代替GBjT12389-1990(食物中胡萝扣素的测定。本标准与GBjT123891990相比主要修改如下=修改了标准的中文名称，标准中文名称改为食品中胡萝卡素的测定川一一增加了高效液相色谱法作为第一法p一一按GBjT20001. 42
2、001(标准编写规则第4部分z化学分析方法对原标准的结构进行了修改。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准第法由卫生部食品卫生监督检验所负责起草，北京市卫生防疫站、中国预防医学科学院环境卫生监测所参加起草。本标准第二法的主要起草人:杨祖英、李良学、张伟平、孙淳、姚孝元。本标准第二法由中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所负责起草。本标准第二法的主要起草人:赵忠林、王光亚、王竹、王国栋。原标准于1990年首次发布，本次为第一次修订。601 GB/T切09.83一2003百|言胡萝卡素是人体重要营养素，它是维生素A的前体，是保健食品的重要成分，6g胡萝卡素相当于1问维生素A。我国于1977
3、年批准胡萝卡素作为着色剂加入奶油及膨化食品中，目前已允许加入饮料、黄油、冰漠淋等14种食品中。1993年批准R胡萝卡素作为营养加强剂加入婴幼儿食品、乳制品中。由于1990年制定的食物中自胡萝卡素的测定方法(GB/T12389-1990)操作烦琐，本次修订提出快速、街便、准确度、精密度较好的高效液相色谱法测定食品中日胡萝卡素，作为第法。原食物中胡萝卡素的测定方法(GB/T12389-1990)作为第二法。602 GB/T 5009.83-2003 食晶申胡萝卡素的测定1 范围本标准规定了食品中胡萝卡素的测定方法一一-高效液相色谱法及纸层析法。本标准适用于食品中胡萝素的测定。本方法检出限:高效液相
4、色谱法为5.0mg/kgCL)，线性范围为omg/L100 mg/L;纸层析法为0.11降，线性范围1ng20鸣。第-法高效液相色谱法2 原理试样中的自胡萝卡素，用石油隧+丙酣(80+20)混合液提取，经三氧化二铝柱纯化，然后以高效液相色谱法测定，以保留时间定性，峰高或峰面积定量。3 试弗j3.1 石油隧z沸程30C60C。3.2 甲董事z色谱纯。3.3 丙醇。3.4 己烧。3.5 四氢峡喃。3.6 三氯甲烧。3.7 乙腊z色谱纯。3.8 三氧化二铝z层析用，100目200目，140C活化2h，取出放人干燥器备用。3.9 含确异辛烧溶液精确称取腆1mg，用异辛烧溶解并稀释至25mL，摇匀备用。
5、3.10 .-胡萝卡素标准溶液z精确称取1mg胡萝卡素.加入少量三氯甲烧溶解，然后用石油隧溶解并洗涤烧杯数次溶液转入25mL容量瓶中，用石油酷定容，浓度为40吨/mL，于一18C储存备用。3.11 日-胡萝卡素标准溶液:精确称取自-胡萝卡素12.5mg于烧杯中，先用少量三氯甲烧溶解，再用石油隧溶解并洗涤烧杯数次，溶液转入50mL容量瓶中，用石油隧定容，浓度为250g/mL，一18C储存备用。两个月内稳定。根据所需浓度取一定量的自胡萝卡素标准液用移动相稀释成100g/mL。3.12 胡萝卡素标准使用液g分别吸取声胡萝扣素标准溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于10mL 容量瓶
6、中，各加移动相至刻度，摇匀后，即得自胡萝卡素标准系列，分别含F胡萝卡素5、10、20、30、40、50g/mL。3.13 胡萝卡素异构体z精确称取1.5 mg 一胡萝扣素于10mL容量瓶中，充人氮气，快速加入含腆异辛烧溶液10mL，盖上塞子，在距20W的荧光灯30cm处照射5min，然后在避光处用真空泵抽去溶剂，用少量三氯甲烧溶解结晶，再用石油隧溶解并定容至刻度，浓度为150问/mL，-18C保存。4 仪器4.1 高效液相色谱仪。4.2 离心饥。4.3 旋转蒸发仪。603 GB/T 5009.83-2003 5 分析步骤5.1 试样提取5. 1. 1 淀粉类食品=称取10.0g试样于25mL带
7、塞量筒中(如果试样中胡萝卡素量少，取样量可以多些).用石油酷或石油腿+丙嗣(80+20)混合液振摇提取，吸取上层黄色液体并转人蒸发器中，重复提取直至提取液元色。合并提取液，于旋转蒸发器上蒸发至干(水浴温度为30(;)。5. 1. 2 液体食品:吸取10.0mL试样于250mL分液漏斗中，加入石油隧十丙酣(80十20)20mL提取，然后静置分层，将下层水溶液放入另一分液漏斗中再提取，直至提取液无色为止。合并提取液，于旋转蒸发器上蒸发至于(水浴温度为40C)。5. 1. 3 泊类食品:称取10.0g试样于25mL带塞量筒中，加入石油酷+丙酣(80+20)提取。反复提取，直至上层提取液元色。合并提取
8、液，于旋转蒸发器上蒸发至于。5.2 纯化将5.1.1.5. 1. 2.5. 1. 3的试样提取液残渣，用少量石油酷溶解，然后进行氧化铝层析。氧化铝柱为1. 5 cm(内径)X4cm(高)。先用洗脱液丙周+石油隧(5十95)洗氧化铝柱，然后再加人溶解试样提取液的溶液，用丙酣十石油酷(5十95)洗脱胡萝卡素，控制流速为20滴/rnin，收集于10mL容量瓶中，用洗脱液定容至刻度。用0.45m微孔滤膜过滤，滤液作HPLC分析用。5.3 测定5.3.1 HPLC参考条件:色谱柱，SpherisorbC18往4.6mmX 150 mm; 流动相:甲醇+乙脯(90+10); 流速，1.2 mL/min;
9、波长，448nm。5.3.2 试样测定:吸取5.2中己纯化的滚滚20L依法操作，从标准曲线查得或回归求得所含萨胡萝卡素的量。5.3.3标准曲线g分别进标准使用液20L.进行HPLC分析，以峰面积对自-胡萝卡素浓度作标准曲线。6 结果计算见式(1)。VXc x二X 1 000 X一一一一一一一一一( 1 ) m .,. . . I 000 X 1 000 式中:X 试样中自胡萝卡素的含量，单位为克每干克(或克每升)g/kg(或g/L)丁，V 定容后的体积，单位为毫升(mL);C试样中自胡萝素的浓度(在标准曲线上查得).单位为微克每毫升(g/mL);m一一一试样的量，单位为克(或毫升)g(mL斤。
10、计算结果保留两位有效数字。7 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。604 GB/T 5009.83-2003 第二法纸层析法8 原理试样经过皂化后，用石油髓提取食品中的胡萝卡素及其他植物色素，以石油酷为展开剂进行纸层析，胡萝卡素极性最小，移动速度最快，从而与其他色素分离，剪下含胡萝卡素的区带，洗脱后于450nm 波长下定量测定。9 试剂9.1 石油隧(沸程30C60C) ，同时是展开剂。9.2 氢氧化饵溶液0+1)，取50g氢氧化饵溶于50mL水。9.3 元水乙醇:不得含有醒类物质。9.3.1 检验方法$9.3. 1. 1 银氨液:加浓氨水于5%硝酸
11、银液中，直至氧化银沉淀溶解，加入2.5mol/L氢氧化纳溶液数漓，如发生沉淀，再加浓氨水使之溶解。9.3. 1. 2 银镜反应:加2mL银氨液于试管内，加入几滴乙醇摇匀，加入少许2.5mol/L氧氧化纳溶液加热。如乙醇中无醒，则没有银沉淀，否则有银镜反应。9.3.2 脱酵方法z取2g硝酸银溶于少量水中，取4g氢氧化销溶于温乙醇中，将两者倾人1L乙蹲中，暗处放置两天(不时摇动，促进反应)，过滤，滤液倾人蒸馆瓶中蒸馆，弃去初蒸的50mL。乙醇中含醒较多时，硝酸银用量适当增加。9.4 元水硫酸例。9.5 胡萝卡素标准溶液9.5.1 胡萝卡素标准贮备液:准确称取50.0mg 胡萝卡素标准品，溶于100
12、.0mL三氯甲烧中，浓度约为500g/mL，准确测其浓度。标定浓度的方法如下:取标准贮备液10.0L，加正己烧3.00mL.混匀。测其吸光度值，比色杯厚度为1cm，以正己烧为空白，人射光波长450nm，平行测定三份，取均值。按式。)计算溶液浓度1-I nAU qu-n A-E -X .( 2 ) 式中:X 胡萝卡素标准溶液浓度，单位为微克每毫升(g/mLl, A一一吸光度值;E-胡萝卡素在正己烧溶液中，人射光波长450nm，比色杯厚度1cm，溶液浓度为1mg/L的吸光系数，为0.2638，3.01 百百T测定过程中稀释倍数的换算系数。9.5.2 日胡萝卡素标准使用液:将已标定的标准液用石油隧准
13、确稀释10倍，使每毫升溶液相当于50月，避光保存于冰箱中。警告=通常标准晶不能全溶解于有机溶剂中，必要时应先将标准晶皂化，再用有机溶剂提取，用蒸锢水洗涤至中性后，浓缩定窑，再进行标定。由于胡萝卡素很容易分解。所以每次使用前，所用标准晶均需标定，在测定试样时需带标准晶同步操作。10 仪器10.1 实验室常用设备。605 GB/T 5009.83-2003 10.2 玻璃层析缸。10.3 分光光度计。10.4 旋转蒸发器=具配套150mL球形瓶。10.5 恒温水浴锅。10.6 皂化回饱装置。10.7 点样器或微量注射器。10.8 滤纸:18cmX30 cm。定性，快速或中速。11 分析步骤以下步骤
14、需在避光条件下进行。11. 1 试样预处理11. 1. 1 皂化取适量试样，相当于原样1g5 g(含胡萝卡素约20月80g)匀浆，粮食试样视其胡萝卡素含量而定，植物油和高脂肪试样取样量不超过10日。置100mL带塞锥形瓶中，加脱醒乙醇30mL，再加10 mL氢氧化饵溶液o十1)，因流加热30m口，然后用冰水使之迅速冷却。皂化后试样用石油酷提取，直至提取液元色为止，每次提取石油隧用量为15mL25 mL。11. 1.2 洗涤将皂化后试样提取液用水洗涤至中性。将提取液通过盛有10g元水硫酸销的小漏斗，漏入球形瓶，用少量石油磁分数次洗净分液漏斗和无水硫酸锵层内的色素，洗涤液并人球形瓶内。11. 1.
15、 3 浓缩与定容将上述球形瓶内的提取液于旋转蒸发器上减压蒸发，水浴温度为60C，蒸发至约1mL时，取下球形瓶，用氮气吹干，立即加人2.00mL石油勘定容，备层析用。11. 2 纸层析11. 2.1 点样在18cmX30cm洁、纸下端距底边4cm处作一基线，在基线上取A、B、C、D四点(见图1)，吸取O.100 mLO. 400 mL浓缩液01.1.3)在AB和CD间迅速点样。A B C D 18cm 图1E R 11. 2. 2 展开z待纸上所点样液自然挥发干后，将滤纸卷成圆筒状，置于预先用石油酷饱和的层析缸中，进行上行展开。11. 2. 3 洗脱z待胡萝卡素与其他色素完全分开后，取出滤纸，自
16、然挥发干石油酶，将位于展开剂前沿的胡萝卡素层析带剪下，立即放入盛有5mL石油酷的具塞试管中，用力振摇，使胡萝卡素完全溶人试剂中。11.3 那定用1cm比色杯，以石油隧调零点，于450nm波长下，测吸光度值。以其值从标准曲线上查出自胡萝卡素的含量，供计算时使用。606 GB/T 5009.83-2003 11. 4 标准工作曲线绘制取日胡萝卡素标准使用液(浓度为50g/rnL)1. 00、2.00、3.00、4.00、6.00、8.00 rnL，分别置于100 rnL具塞锥形瓶中，按试样分析步骤进行预处理和纸层析，点样体积为0.100rnL，标准曲线各点含量依次为2.5、5.0、7.5、10.0
17、、15.0、20.0月。为测定低含量试样，可在0至2.5g间加做几点，以自胡萝卡素含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。12 结果计算试样中胡萝卡素含量按式(3)计算。式中:V , 100 X=m, X口丘X一一m X一一试样中胡萝卡素的含量(以R胡萝卡素计)，单位为微克每百克(g/100g); m, 在标准曲线上查得的胡萝卡素质量，单位为微克(p.g); V , 点样体积，单位为毫升(rnL); V2 试样提取液浓缩后的定容体积，单位为毫升(rnL); m 试样质量，单位为克(g)。计算结果保留三位有效数字。13 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。.( 3 ) 607
