1、中华人民共和国城镇建设行业标准生活垃圾渗沥水总大肠菌群的检测多管发酵法Leachate-Detection for members _of the coliform group-Multiple-tube fermentation method CJ/T 3018. 1S一眼1 主题内容与适用范围本标准规定了用多管发酵法检测渗沥水中总大肠菌群的方法。本标准适用于从生活垃圾中渗出来的液体。2 引用标准GB 5750生活饮用水标准检验法总大肠菌群GB 4789 .3食品卫生微生物学检验大肠菌群测远3 术语总大肠菌群系指一群需氧及兼性厌氧的，在37生长时能使乳糖发酵，在24h内产酸、产气的革兰民阴性
2、无芽抱杆菌。总大肠菌群数系以每升咨沥水样品内，总大肠菌群的最可能数（MPN）表示。4 原理根据总大肠菌群具有的生物持征，如革兰氏阴性无芽于包杆菌，在37于乳糖内培养能发酵，并在24h内产酸、产气的特点，将不同稀释度的试样接种到具有选择性的乳糖培养基中，经培养后根据阳性反应结果，测出原试样中总大肠菌群的MPN值。5 培养基和试剂本标准所用试剂，除另有说明外，均为符合国家标准或行业标准的化学纯试剂和生化，试剂，均用蒸锢水或去离子水。5. 1 乳糖蛋白陈培养液5. 1 . 1 成份z蛋白陈lOg 中华人民共和国建设部1993-05-03批准199309-07实施54 5. 1. 2 制法牛肉膏乳糖氧
3、化铀CJ/T 3018. 15- 93 1.6%澳甲酣紫乙醇榕液蒸馆水3g 5g 5g lmL lOOOmL 将蛋白陈、牛肉膏、乳糖及氯化铀置于lOOOmL蒸锢水中加热溶解，调整pH为7.27.4，再加入lmLl.6%澳甲酣紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有倒管的试管中，置高压蒸汽灭菌器中，以115C灭菌20min，贮存于冷暗处备用。5.2 三倍浓缩乳糖蛋白陈培养液按上述乳糖蛋白陈培养液（5 .1）浓缩三倍配制。5.3 品红亚硫酸铀培养基.s. 3. 1 成份z蛋白陈乳糖磷酸氢二饵lOg lOg 3.5g 琼脂15 30g 蒸馆水lOOOmL 无水亚硫酸铀 5g 5%般性品红乙醇搭液20mL S
4、.3.2 储备培养基的制备先将琼脂力日至900mL蒸锢水，加热溶解，然后加入磷酸氢二饵及蛋白陈，？昆匀使其溶解。再用蒸馆水补足到lOOOmL，调整pH为7.27.4，趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内，置高压蒸汽灭菌器中以115灭菌20min，贮存于冷暗处备用。5.3.3 平板培养基的配制将上法制备的储备培养基（5.3.2）加热融化，根据烧瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例吸取一定量的5%碱性品红乙醇溶液，置于灭菌空试管中，再按比例称取所需的无水亚硫酸铀置于另一个灭菌空试管内，）Jn灭菌水少许使其溶解后，置于沸水浴中煮沸lOmin以灭菌。用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸铀溶
5、液，滴加于碱性品红乙醇溶液内至深红色褪成淡粉纽色为止。将此亚硫酸铀与碱性品红的混合液全部加入已融化的储备培养基内，并充分混匀（防止产生气泡），立即将此种培养基适量倾入于已灭菌的空平皿内，待其冷却凝固后，倒置冰箱内备用。此种己制成的培养基于冰箱内保存应小于两星期，如培养基已由淡红色变成深红色，则不能再用。5.4 伊红美蓝培养基5.4.1 成份z蛋白陈lOg 乳糖lOg 55 磷酸氢二饵琼脂蒸锢水CJ/T 3018.15-93 2g 20 30g lOOOmL 2%伊红水溶液20mL 0.5%美蓝水榕液13mL 5.4.2 储备培养基的制备先将琼脂加至900mL蒸锢水，加热溶解，然后加入磷酸氢二饵
6、及蛋白陈，混匀使之溶解，再用蒸锢水补足到lOOOmL，调整pH为7.27.4，趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内，置高压蒸汽灭菌器中以115灭菌20min，贮存于玲暗处备用。5.4.3 平板培养基的配制将上法制备的储备培养基（5.4.2）加热融化，根据烧瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例分别腹取一定量巳灭菌的2%伊红水溶液及一寇量已灭菌的0.5%美蓝水溶液，加入已融化的储备琼脂内，并充分混匀（防止产生气泡），立即将此种培养基适量倾入于已灭菌的空平皿内，待其冷却凝固后，倒置冰箱内备用。5.5 生理盐水将8.509.50g氯化铀（NaCl)溶于水中，稀释成lOOOmL，摇匀
7、。pH值应为4.57.0o 6 仪器、设备6. 1 高压蒸汽灭菌器。6.2 干燥箱z最高工作温度300。6.3 恒温培养箱r36土1。6.4 冰箱。6.5 恒温水浴：46士1。6.6 生物显微镜。6.7 稀释瓶：125mL小口玻璃方瓶。6.8 玻璃试管：18180mm。6.9 玻璃倒管：330m川6. 10 刻度吸管rlmL, lOmL，分度至O.lmLo 6. 11 载玻片。6. 12 平皿z直径90mm。6. 13 接种环z直径3mm。6. 14 酒精灯。1 样晶供总大肠商群检测的渗沥水实验室样品量约需lOOmL，用经灭菌处理过的玻璃瓶采集e采样后应尽快检测，在2h内不能处理时，应置于25
8、冷藏，最民保存时间为他。56 CJ/T 31H8 . 15-93 8 步骤8. 1 准备工作8 .1.1 工作室及操作台经清扫后，用紫外线灭菌lOmin。8.1.2 玻璃器皿置于干燥箱中于160灭菌2h。8.1.3 将装有90mL生理盐水的稀释瓶和9mL生理盐水的试管，前者瓶口橡皮塞衬上滤纸条，后者管口塞上棉花球，置高压蒸汽灭菌器（6.1）内，于121灾菌20min，冷却待用。8.2 试样稀释8. 2.1 以无菌操作，吸取经充分混匀的试样lOmL于盛有90mL灭菌生理盐水的稀释瓶(8.1.3）中，充分混匀后就成1I 10的稀释液。8.2.2 吸取1: 10稀释液lmL，沿管壁徐徐注入盛有9mL
9、灭菌生理盐水的试管中，混匀成1 : 100的稀释液。8. 2. 3.按上述操作进行10倍递增稀释，每递增稀将1次，随即换用1支1mL灭菌刻度吸管。8.3 发酵试验以无菌操作，选择适宜的四个连续稀释试样lmL，接种到各装有lOmL乳糖蛋白陈培养液（5.1）的试管（内有倒管）中，若其中取lOmL原试样，则需注入装有5mL三倍浓缩乳糖蛋白陈培养液（5.幻的试管（内有倒管）中，混匀后置于36士1的恒温培养箱内培养24士础。8.4 平板分离培养取出经培养24h后的发酵试管，将产酸产气及只产酸的发酵管，分别接种于品红亚硫酸铀平板培养基（5.3.3）或伊红美蓝平板培养基（5.4.3）上，再置于36士1恒温培
10、养箱内培养1824h。挑选符合下列特征的菌落，取菌落的半进行涂片。革兰民染色、镜检（见附录A）。品红亚硫酸铀培养基上的菌落紫红色，具有金属光泽的菌落。深红色，不带或略带金属光泽的菌藩。淡红色，中心色较深的菌落。伊红美蓝培养基上的菌落a深紫黑色，具有金属光泽的菌落。紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落。淡紫红色，中心色较深的菌落。8.5 证实试验上述涂片、镜检的菌落，如为革兰氏阴性无芽抱杆菌，则挑取该菌落的另一半再接种于装有lOmL普通浓度乳糖蛋白陈培养液（5.1）的试管（内有倒管）中，然后置于36士1恒温培养箱中培养24础。有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在。57 3018.15-93 CT报告
11、方式根据证实试验有总大肠菌群存在的阳性管数，查MPN检索表（表1), MPN值在100以内时，按其实际取值表示，大于100时，用10的指数形式表示，并以每升渗沥水样品净的总大肠菌群的MPN值报告。9 本标准来悻规定的接GB5750和GB4789. 3执行10 大肠菌群最可能数（MPN）检索袭表1MPN/lOOOmL 接种量，mL：.川 io1 . 10 1 io-1 10- . 10 1 10槐 1 101 101 0.1 l I , 10- - 2.38 105 z. 38 io 9 10 9.5 10 1. 8 101 1. 9 101 2.2x101 2.3 10z 2.8 101 9.
12、2 102 9.4 102 1. 8 103 2.3 103 9.6X 101 2.38 10 2.38 104 9 10 9 10 - 十+ 十+ + 十+ + 十十+ + + 十+ + + 十+ 十58 十十+ CJ/T 3018. 15-93 附录A革兰民染色和镜幢（补充件）Al 革兰民撬色Al. 1 染色液配制Al.1.1 结晶紫染色液结晶紫1.0g 95%乙醇20.0mL 1%草酸镀水榕液80.0mL 将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸镀溶液混合结晶紫溶液放置过久产生沉淀，不能再用。Al.1.2 腆助染液腆1.0g腆化饵2.0g 蒸懦水300.0mL 将腆和腆化伺先行混合，加少许蒸
13、榴水充分振摇，待完全溶解后，再用蒸锢水稀碍至300mL。此溶液二星期内有效。当溶液由棕黄色变成诙黄色时，即应弃去Al.1.3 乙醇脱色液，95%(V/V）乙醇。Al.1.4 抄黄复染液抄黄0.25g 95o/o乙醇10.0mL 蒸馆水90.0mL 将沙黄溶于乙醇中，待完全溶解后，加入90mL蒸馆水。A 1.2 染色黄步骤A 1. 2. 1 涂片用灼烧冷却后的接种环挑一环2%生理盐水于清洁无脂的载玻片上，再用接种环从培养1824h符合菌落特征的平板中取菌落的一半沾于盐水滴的上端，烧去接种环上多余的菌落。然后用接种环将菌种在盐水中均匀涂开，要涂得薄些（形成可见的薄层），然后将标本向上，在火焰上方加
14、温固定，干燥、冷却。A 1. 2. 2 染色滴加结晶紫染色辘，染色lmin，倾去染色液，水洗。滴加腆助染液，作用lmin后倾去，水洗。滴加乙醇脱色液，摇动载玻片，直至无紫色脱落为止（约30s），水洗。59 。1J/T3018. 1号臼滴加沙黄复染液，染色lmin后倾去，水洗。晾干，镜检的镜撞滴香柏油，在高倍油镜下观察，呈深费也为：革兰民阳性菌，呈淡红色为革兰民阴性菌二附加说明z本标准由建设部栋准定额研究所提出。本标准由建设部城镇环境卫生技术标准归口单位上海市环境卫生管理局归口本标准由上海市环境卫生设计科研所负责起草本标准主要起草人庄启化、章莉娜。本标准委托上海市环境卫生设计科研所负责解释60 京新登字035，：哥哥中华人民共和国城镇建设行业标准生活垃圾渗洒水理化分析和细菌学检验方法CJ/T 3018.l 15-93 * 中国建筑工业出版社出版、发行（北京西郊百万庄新华书店经销北京市顺义县燕华印刷广印刷,. 开本：7871092毫米1/16印张：4字数：“千字1993年12月第一版1993年12月第一次印刷印数：1-700册定价：1.75元ISBN7-l12-02158-8/TU 1656 (7178) 问1l巳iF户口问2. 75元ISBN7-112-02158-8/TU 1656 定价z(7178).
