1、ICS 11.220 B 41 DB13 河北省地方标准DB13/T 946-2008 蛋禽H5亚型禽流感免疫抗体卵黄检测技术规程200803一揭发布20出一0412实拖河北省质量技术监督局发布DB13/T 946 2008 前盲本标准由河北省畜牧碍医局提出。本蒜准起草单位:梅花省动物疫病嚣防控制中心、河jt省黯牧罄眩研究所本标准主要起草人:郑文援、白玉坤、冯雪领、韩庆安、孟艳、提3号楼、辑秀女、胡自然写武秩琪、刘红、i午五静、美醋、李志民、李商J、张绍军、:X1J乃强。1 范围蛋禽H5亚型禽流感免搜抗体卵黄检测技术规程DB13/T 946-2008 本际航规定了麓禽H5s.那禽流感免疫抗体卵
2、黄检测技术中的样本采巍、试验准备飞试验方法、结果判定等操作方暗。本标准适用于用卵黄进行最禽旧亚型禽流感灭活疫苗免搜抗体检测。2 规范性引用文件下到文件中的条款通过本样攘的引用雨成为本挥准的条盘。凡是主主持踞的百崩文件，其随后所有的惨改单不包括勘误的内容或修订接均不适m于本挥涯，然酶，鼓踉辍据本挥准达成楼议的各方研究是否可以使用这摔文件的最新接本。凡是不注E摆的寻1m文件，其最新殷本远期于本棕准。GB厅18936高致茹性禽深感诊新技术3 末i毒和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1 蛋禽已经产蛋的禽类。3.2 检样经过直接稀释成氯仿3存取制各好的、用于拉割的样品。3.3 跳管血凝抑制j试验中，
3、部检祥在反应板上出现能爵、后孔凝集抑制雨中部孔凝蝶的现象。4 样本采集采集蛋篱免接接科技5豆豆黯禽琉惑灭活疫苗21d后所产的革开鲜禽蛋。5 试建准备5.1 材料准备5.1.1 仪器设备96孔900y型橄最反应板、微草去移掖器、滴头、微量振荡器、离心机、液体快速搅合器、容量题。5.1.2 试剂a)葡萄糖、拧栋酸销、拧蝶般、氟化锅、磷酸氢二锅、磷般二室豆制、氮氧化锅、荒草委等。b)禽流感病毒H5亚细则抗原、常流感病毒H5亚塑阳性盘清和阴性应溃。5.2 试班配制i5.2.1 阿民(Alsevers)液黠都称取葡萄糖2.05葱、拧穰酸锅0.8g、拧棱鼓0.055g、氯住销0.42g，用i蠢蠢菜锚7(搭
4、解后，移入looml容量瓶中，2主静。那0.01moVL鳖氧化黯或0.01moVL盐酸满pH最至6.1，69 kPa离压灭霞15min , DB13/T 946 2008 4t:保存备用。5.2.2 1%鸡红摇摇般液配制采集茧少三只SPF公鸡或无禽就感和新域疫等抗体的程康公鸡的血液与等掉我问氏液混合，踊pH7.2 0.01 mo也PBS洗涤3次，每次均以1000 r/min离心10min，洗涤黯窍PBS配成1%(VN)红如黯悬滚，4t:保存备窍。5.2.3 0.01 mol!L PBS试班a)称取磷最氧工铀2.74g，磷酸工氧铀0.79g.用适量蒸嬉水部解后，移入100mL容量跑中，定溶。b)
5、 量敢上述辞辛接40ml，加入氧化辑8.5g挥手解后，移入1omL容赣瓶中，定搭。c)用0.01mol/L氢氧化制成0.01moVL盐股潮pH道菜7.2，高压灭蘑菇用。5.3 检样辈tl备5.3.1 拥黄直接稀辑在样品管中加入0.5ml PBS液再i毁啦。.5ml卵黄做1:1稀释，槐勾制成重要黄检样备用。5.3.2 卵麓氯仿萃瑕骂是5.3.1制备好的部黄检样0.4ml细人等黯氧告，迅速用液体快速混合器充分振荡远匀，3夜温静置30 mn , 30r/min离心5min，取上清被备用。6 试磁1i法6.1 抗原血凝效给露定(HA试翰，微量活)操作方法接GBff18936执衍。6.2 血凝挥寄Ij(
6、HI)试验锻董法)6.2.1 赔黄直接稀辑割2立法操作方法按GB厅18936执行。用5.3.1中制备的鼻黄稳样代替血;需进行检测。检拥时在挥准阳性Jl清和阴性血清对照。6.2.2 董氯傍革取制定法6.2.2.1 适用建国在野黄直接稀释测定法检测出现跳管或测不出拭本时，采用W萦氧告萃取法检割。6.2.2.2 方法操作方法按GB厅18936执行。南5.3.2中骂道备的栓样代替Jl清进行检测。检费M设标准阳性血?育和i阴性血清对黑。7 结果捋定7.1 试验结果成立条件只有阴性辩摆孔血清滴度不大于22，阳性对黑子L血清误经不摇过1个调皮，试验结果才有效。7.2 HI漓度的计算方法以完全抑制4个HAU抗
7、原的样本最高稀释倍数作为HI漓度。样本最i备过程中卵茧的稀释带数和加入氯甜麓都计人该样本的稀释倍数。7.3 判定方法7.3.1 黄革接稀辑测定法黯巢判定将捡样制备过程中样本的稀释倍数计入终点滴1t费定即:微量反应毅上血凝抑制龄搀点滴皮茄个精度为该样本的HI抗体鼓拚费点滴度为零时窍不再加)。举倒:微量反应板上盘凝拇制的终点滴度是27，翼IB亥辛辛本刊I抗体效份为2807.3.2 卵黄氯坊萃取测定2去结果笋j定2 DB13/T 946-28 将检样黯i备过程中样本的稀释倍数计人终点濡度判定，即:散量反应桂上血凝抑制的终点滴度加两个漓度为该样本的HI抗体效价(费点滴度为零时则不再加。举例:擞赣反应板上血凝拇模的终点瘸寰是27，如!该样本HI抗捧效价为29。8 免摄抗体食艳判定8.1 个体舍楼判定样本日I抗体效价大于等于24为免疫合格。8.2 群体合格如j定免疫合格群本数占检测总样本数70%(以上包括70%)判为群体合格。3
