1、G8/T 5413.11-1997 前言本标准给出两种方法，方法一是荧光法，重现性好，准确度较高。方法二是高压液相色谱法，测定速度快。本标准方法一为仲裁法本系列标准从实施之日起，代替GB5413-85。本标准由中国轻工总会提出，本标准由全国乳品标准化中心归口。本标准负责起草单位z国家乳制品质量监督检验中心、浙江省轻工业研究所。本标准参加起草单位z卫生部食品卫生监督检验所、哈尔滨森永乳品有限公司、雀巢(中国)投资服务有限公司.本标准主要起草人g李茂胜、任一平、黄百芬、郎昭斌、陈青俊、王芸。263 中华人民共和国国家标准婴幼儿配方食品和乳粉维生素81的测定Mllk powder and rormu
2、la roods ror Inrant and young chlldren 一-Determlnatlonor vltamin B, content 1 范围本标准规定了用荧光法和反相高压液相色谱法测定维生素矶的方法。GB!T 5413.11 1997 代替GB5413-85 本标准方法一适用于乳粉中维生素队的测定$方法二适用于婴幼儿配方食品和乳粉中维生素矶的测定。方法一荧光法2 方法原理样品在稀盐酸溶液中消化，过滤，除去蛋白质等物质。如果样品中维生素B，系游离态，可直接在碱性铁氟化饵中氧化成哩IIA!色素，在紫外光照射下发出荧光，其荧光强弱与唾嗜色素成正比z如果维生素B，系结合态，则须经酶
3、解转为游离态，层析除去杂质后再作荧光检测.检测所使用的激发波长E，为365nm，发射波长EM为435nm.3试lfIJ所有试剂，如未注明规格，均指分析纯;所有实验用水，如未注明其他要求，均指三级水。3. 1 盐酸:c(HC)为0.1mol/L.3.2 氢氧化销:c(NaOH)为150g!L。3. 3 异了醇g重蒸馅。3.4 乙酸销:c(NaAc)为2mol!L 3.5 酸性乙醇z体积分数为20%.用盐酸调节pH为3.54. 3. 3.6淀粉酶(生化试剂溶液:100g!L 3. 7 中性氯化饵:c(KC)为250日!L.250g氯化饵溶于1000mL水中。3. 8 酸性氯化仰:c(KC)为250
4、g!L。加8.5mL盐酸于1L中性氯化何溶液中。3.9 铁氟化饵:cK，Fe(CN)，J为10g!L，使用当天配制。3.10 氧化剂.3. 11 标准溶液3. 11. 1 维生素战标准贮备液，浓度为100g!mL。准确称取50.0m趴在五氧化二磷干燥器内至恒量的)分析纯维生素B，盐酸盐，溶解于400mL左右体积分数为20%的酸性乙醇溶液(3.5)中，并定容于500mL棕色容量瓶中，于10C左右贮存。取4毫升10日!L的铁佩化饵(3.份，用150g/L的氢氧化销溶液(3.2)稀释至100mL，配好后置于暗国京技术监督局1997-05-28批准1998-09-01实施264 GB/T 5413.1
5、1-1997 处4h内使用。3. 11. 2 维生素B，标准工作液，浓度为3g/mL吸取上述标准贮备液3mL.用O.lmol/L盐酸(3.1)稀释至100mL.每次实验须新鲜配制。3.12 乙酸，体积分数为3%5%。将30mL冰乙酸用水稀释至1000mL.3.13 活化人造沸石.4060目，化学纯。沸石的活化g称取100g人造沸石于大烧杯中，加十倍体积的热乙酸(3.12).在搅动下煮沸lSmin，待澄清后弃去乙酸溶液，如此重复三次，再加五倍体积的热酸性氯化饵溶液(3.8) .于搅拌下煮沸15min，待澄清后弃去氯化饵溶液，重复三次，然后再用热水洗至无氯离子存在，用布氏漏斗抽滤，于100C烘箱干
6、燥，保存于不漏气的广口瓶中.4 仪器常用实验室仪器及24. 1 荧光分光光度汁。5 操作步骤5. 1 抽提于150mL三角瓶中准确称取3g左右样品，加盐酸(3.1) 50mL.用铝筒纸盖住瓶口，在137. 2161. 7kPa压力下(125C)消化半小时，同时吸取5mL标准工作液(3.11. 2)于150mL三角瓶中，加入约50mL盐酸(3.1).在137.2161. 7kPa压力(125C)下消化半小时，冷却后，用乙酸销(3.4)调pH值为4.5.然后加5mL酶溶液(3.6).在37C条件下保温过夜，冷却后调节pH为3.5.于100mL容量瓶中加水定容，过滤。5.2 层析5.2.1 称2g左
7、右经活化的人造沸石(3.13).湿法装柱。5.2.2 吸取10mL滤液，通过沸石柱层析，流速控制在运0.5mL/min.弃去滤液。5.2.3 用近沸腾的蒸馆水洗涤沸石三次，每次5mL.再用7080C的酸性氯化饵(4.8)洗柱五次，每次44. 5mL.弃去初滤液1mL.集合滤液于25mL容量瓶中，冷却，用酸性氯化御溶液(4.8)稀释至刻度。5.3 氧化在四支50mL的试管中，分别加入1.5g氯化销或氯化饵固体及5mL标祥(5.2.3).在其中二个试管中，立即加入3mL氧化剂(3.9).tlt匀，立即加入13mL异丁醇(3.3).猛烈振摇158以上，静止分层，待荧光测定，另二管不加氧化剂，以3mL
8、的氢氧化纳(3.2)代替，作为空白。同时吸取样液5mL(5.2. 3)于另四支试管中，作法同上。5.4 荧光测定从每一试管中吸上层清液作荧光测定。6分析结果的寝述样品中维生素BI(mg/100g)=(1, - Ib) X c X5 100 (l - Ib) X m X 1 000 式中，1.-样品荧光值3h一一样品空白荧光值;Id-标样荧光值;I.b-一标样空白荧光值;C一标样浓度，g/mL. ( 1 ) 265 G8/T 5413.11-1997 m一一佯品的质量.g0 7 允许莞同一样品的两次测定值之差不得超过两次测定平均值的5%。方法二反相高压液相色谱法8 方法提要样品在稀盐酸环境中高温
9、水解、酶解，样液用碱性铁氟化饵衍生，正丁烧萃取后，经ODSC1，反相色谱柱分离，在荧光检测器(E375nm. Em 435nm)条件下检测，用外标法定量维生素矶的含量。2试11119. 1 正丁醇。9.2 铁氟化御。9.3 浓盐酸。9.4 无水乙酸锵。9.5 冰乙酸。9.6 甲醇.色谱纯。9.7 硫胶素(维生素B1)，标准品。9.8铁氟化侨溶液，cK，Fe(CN)，J为10日/L。称取2g铁氟化僻，溶解并稀释至200mLo9.9 氮氧化销揭穿液，c(NaOH)为100g/L。称取20g氢氧化纳固体，溶解并稀释至200mLo9. 10 碱性铁氧化饵溶液，lOg/L铁氟化饵溶液(9.8)5mL与1
10、00g/L氢氧化锵溶液(9.9)200mL混合。9. 11 盐酸溶液，c(HC)为0.1mol/Lo吸取4.5mL浓盐酸，溶于500mL去离子水。9.12 盐酸溶液，c(HCl)为O.Olmol/L。吸上述0.1mol/L盐酸溶液50mL配制成500mL9.13 乙酸销溶液(pH=4.5) ，c(NaAc)为0.05mol/L。称取4.10g乙酸锅固体，配成1000mL.并用冰乙酸调至pH=4.509.14 乙酸纳溶液，c(NaAc)为2.0mol/L。称取16.61g乙酸俐，配制成100mLo9.15 混合酶溶液.30g/L。称取淀粉酶和木瓜酶各3.6g.溶于100mL2mol/L乙酸纳溶液
11、。9.16 流动相配和，用0.05mol/L乙酸销溶液与甲醇按适当比例棍合。9.17 标准溶液9. 17. 1 维生素B，标准储备溶液，浓度为500g/mLo精确称取0.0500g维生素B，(9.7).用0.01mol/L盐酸(9.11)溶解并定容于100mL容量瓶中，放冰箱中保存。9.1 7.2 维生素B，标准工作液，浓度为O.5附/mL将标准储备液用重蒸水稀释1000倍，所得溶液经0.3m滤膜过滤。10 仪器10. 1 高效液相色谱仪或具同等性能的高效液相色谱仪。10.2 荧光分光仪(带9L流动池)或具波长可调功能的等同性能荧光检测器a10.3 C反相色谱柱(dp5m，25cmX4.6mm
12、)或具同等性能的色谱柱.10.4 组织捣碎机(1OOOO 12000r /min)。10.5 高压杀菌锅。266 11 操作步骤11. 1 样品处理GB/T 5413. 11-1997 11. 1. 1 称样2将样品放入捣碎机中捣碎后，精确称取5.010.0g(内含维生素B15用以立于三角瓶中。11.1.2 水解g加适量的盐酸溶液(9.11).控制样液中酸浓度在0.1mol/L左右，将三角瓶内的样液摇匀后，放入高压杀菌锅内，在121C下保持30min，待冷却后取出，轻摇数次。11. 1.3 酶解z冷却至40C以下，分别加入2.5mL混合酶液(9.15).摇匀后，置于3TC的培养箱中过夜。11.
13、 1.4 定容:用。1mol/L氢氧化锅溶液调pH值至6.0左右，再用二次重蒸水定容至100mL。11.1.5 过滤z样液经定量滤纸过滤。11. 1.6 衍生g取滤液10.OOmL (lL 1. 5)于25mL带塞量筒中，加入5mL碱性铁氟化御(9.10)氧化后，充分混匀后再加10.00mL正丁醇(9.1)萃取，经强烈摇动，静止分层后吸取正丁醇相(上层)进祥。11. 2 样品测定11. 2. 1 色谱条件流动相0.05mol/L乙酸销溶液(9.13川甲醇(9.6)(65:35.体积比)。流速:1. 00 mL/min。检测波长2激发波长375nm，发射波长435nm，进样量:20L。12 分析结果的寝述样品中维生素B1的含量(mg/IOOU=cXF X V X 10OHHun-HU-(2) m X 1000 式中:c 进样样液的浓度，用/mL.F一一稀释倍数，V一一定容容积，mL;m一一样品的质量.g。13 允许差13. 1 重复性同样品两次测定结果之差不得超过平均值的5%。13. 2 重现性同样品在两个不同实验室测定结果之差不得超过平均值的5%。267
