1、ICS 67120B 45中华人民共和国国家标准农业部1025号公告一142008动物性食品中氟喹诺酮类药物残留检测高效液相色谱法Determination of fluoroquinolones residues in animal derived foodby lligh performance liquid chromatography20080429发布 20080429实施中华人民共和国农业部发布前言-1范围2规范性引用文件3制样31样品的制备32样品的保存4测定方法41方法提要或原理-42试剂和材料43仪器和设备44测定步骤45结果计算和表述5检测方法灵敏度、准确度、精密度51灵敏
2、度一52准确度53精密度附录A(资料性附录)高效液相色谱图目 次农业部1025号公告一14_2008农业部1 025号公告一1 42008前 言本标准附录A是资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出并归El。本标准起草单位：中国兽医药品监察所。本标准主要起草人：仲锋、刘艳华、汪霞、毕言锋、徐倩、董琳琳、彭莉、岳秀英、高岚。本标准系首次发布的国家标准。农业部1025号公告一142008动物性食品中氟喹诺酮类药物残留检测 高效液相色谱法1范围本标准规定了动物性食品中达氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星和沙拉沙星药物残留检测的制样和高效液相色谱测定方法。本标准适用于猪的肌肉、脂肪、肝脏和肾脏，鸡的肝脏和
3、肾脏组织中达氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星和沙拉沙星药物残留量检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 112000标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则(ISOIEC Directives，Part3，1997，Rules for the structure and drafting of International Standards，NEQ)GBT
4、 6682分析实验室用水规则和试验方法3制样31样品的制备取适量新鲜或冷冻的空白或供试组织，绞碎并使均匀。3 2样品的保存一20以下冰箱中贮存备用。4测定方法4 1方法提要或原理用磷酸盐缓冲溶液提取试料中的药物，cls柱净化，流动相洗脱。以磷酸一乙腈为流动相，用高效液相色谱一荧光检测法测定，外标法定量。4 2试剂和材料以下所用的试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂；水为符合GBT 6682规定的二级水。4 2 1达氟沙星：含达氟沙星(C。Hz。FN。03)不得少于99o。42 2恩诺沙星：含恩诺沙星(c。HzzFN。O。)不得少于990H。4 23环丙沙星：含环丙沙星(c。，H。FN。O。)不得
5、少于99o。424沙拉沙星：含沙拉沙星(H。，F2NzO。)不得少于990H。425磷酸。426氢氧化钠。4 2 7乙腈：色谱纯。428甲醇。429三乙胺。农业部1025号公告一1420084 2 10磷酸二氢钾。4 2 11 50molL氢氧化钠溶液：取氢氧化钠饱和液28mL，加水稀释至100mL。4212 003molL氢氧化钠溶液：取50molL氢氧化钠液06mL，加水稀释至100mL。42 13 005 molL磷酸三乙胺溶液：取浓磷酸34 mL，用水稀释至1 000 mL。用三乙胺调pH至24。4 2 14磷酸盐缓冲溶液(用于肌肉、脂肪组织)：取磷酸二氢钾68 g，加水使溶解并稀释至
6、500 mL，用50 molL氢氧化钠溶液调节pH至70。4215磷酸盐溶液(用于肝脏、肾脏组织)：取磷酸二氢钾68 g，加水溶解并稀释至500 mL，pH为4050。4 2 16达氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星和沙拉沙星标准储备液：分别取达氟沙星对照品约10 mg，恩诺沙星、环丙沙星和沙拉沙星对照品各约50mg，精密称定，用003molL氢氧化钠溶液溶解并稀释成浓度为02mgmL(达氟沙星)和1mgmL(,圃,诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星)的标准储备液。置28冰箱中保存，有效期为3个月。4217达氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星和沙拉沙星标准工作液：准确量取适量标准储备液用乙腈稀释成适宜浓度的达氟沙星、
7、恩诺沙星、环丙沙星和沙拉沙星标准工作液。置28冰箱中保存，有效期为1周。4 3仪器和设备4 3 1高效液相色谱仪(配荧光检测器)。4 3 2天平：感量001 g。4 3 3分析天平：感量0000 01 g。4 3 4振荡器。4 35组织匀浆机。4 3 6离心机。437匀浆杯：30mL。438离心管：50mL。4 3 9固相萃取柱：VarianBondEluto C18柱(100mgmL)。4 310微孔滤膜(o45“m)。：提及公司的信息及标识。除非做了说明，并不意味推荐使用该公司的产品。44测定步骤4 4 1试料的制备试料的制备包括：取绞碎后的供试样品，作为供试试料；取绞碎后的空白样品，作为
8、空白试料；取绞碎后空白样品，添加适宜浓度的对照溶液，作为空白添加试料。4 4 2提取取(2-005)g试料，置30 mL匀浆杯中，加磷酸盐缓冲溶液10o mL，10 000 rrain匀浆1 rain。匀浆液转入离心管中，中速振荡5 min，离心(肌肉、脂肪10 000 rmin 5 mim肝、肾15 000 rrain 10 min)，取上清液，待用。用磷酸盐缓冲溶液100mL洗刀头及匀浆杯，转入离心管，洗残渣，混匀，中速振荡5min，离心(肌肉、脂肪10 000 rmin 5min肝、肾15 000 rrainlorain)。合并两次上清液，混匀，备用。44 3净化固相萃取柱先依次用甲醇、
9、磷酸盐缓冲溶液各2 mL预洗。取上清液50 mL过柱，用水1 mL淋洗，挤干。用流动相10mL洗脱，挤干，收集洗脱液。经滤膜过滤后作为试样溶液，供高效液相色谱法农业部1025号公告一14_2008测定。4 4 4标准曲线的制备准确量取适量达氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星和沙拉沙星标准工作液，用流动相稀释成浓度分别为0005 FtgmL、001肛gmL、00519mL、01肛gmL、03 pgmL、05gmL的对照溶液，供高效液相色谱分析。4 4 5测定4451色谱条件色谱柱：C18 250mmX46mm(id)，粒径5“m，或相当者；流动相：005 molL磷酸溶液三乙胺一乙腈(82+18，vv)
10、，使用前经微孔滤膜过滤；流速：o8mLmin；检测波长：激发波长280 rtrn；发射波长450 nm；柱温；室温；进样量：20止。4 4 52测定法取试样溶液和相应的对照溶液，作单点或多点校准，按外标法以峰面积计算。对照溶液及试样溶液中达氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星和沙拉沙星响应值均应在仪器检测的线性范围之内。在上述色谱条件下，对照溶液和试样溶液的高效液相色谱图分别见附录A中图A1、图A2。446空白试验除不加试料外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。4 5结果计算和表述按式(1)计算试料中达氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星或沙拉沙星的残留量： Y：ACsVlVa“ Asv2M式中：x试料中达氟沙
11、星、恩诺沙星、环丙沙星或沙拉沙星的残留量，单位为纳克每克(ngg)A试样溶液中相应药物的峰面积；As对照溶液中相应药物的峰面积；cs对照溶液中相应药物的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；y。提取用磷酸盐缓冲液的总体积，单位为毫升(mL)；U过c，s固相萃取柱所用备用液体积，单位为毫升(mL)；V。洗脱用流动相体积，单位为毫升(mL)；M供试试料的质量，单位为克(g)。注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。5检测方法灵敏度、准确度、精密度5 1灵敏度达氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星和沙拉沙星在鸡和猪的肌肉、脂肪、肝脏及肾脏组织中的检测限为20 pgkg。5 2准确度本方法在20gkg500 pgkg添加浓度的回收率为60100。5 3精密度本方法的批内变异系数15，批间变异系数20。农业部1025号公告一142008色谱峰：1环丙沙星2达氟沙星3恩诺沙星4沙拉沙星色谱峰：1环丙沙星z达氟沙星3恩诺沙星4沙拉沙星附录A(资料性附录)高效液相色谱图500 1000 15 00 2000 25 00Minutes图A1 氟喹诺酮类药物对照溶液色谱图5 00 10 00 1500 2000 25 00MilIut曙图A 2猪肝脏组织中氟喹诺酮类药物色谱图
