1、ICS 67120B 45中华人民 共禾口 国国家标准农业部1031号公告一22008动物源性食品中糖皮质激素类药物多残留检测液相色谱一串联质谱法20080509发布Determination of glucocorticoids residuesin animal products C-MSMS method20080509实施中华人民共和国农业部发布刚 罱农业部1031号公告一22008本标准的附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。本标准起草单位：华中农业大学、北京市食品安全监控中心、河南省兽药监察所、福建省兽药监察所。本标准主要起草人：袁宗辉、陈冬梅、陶燕飞、王玉莲
2、、刘振利、彭大鹏、黄玲利、戴梦红、黄华、路勇、班付国、宋志超、贾振民、林永。本标准系国内首次发布的国家标准。农业部1031号公告一22008动物源性食品中糖皮质激素类药物多残留检测 液相色谱一串联质谱法1范围本标准规定了动物源性食品中糖皮质激素类药物残留检测的液相色谱串联质谱测定法。本标准适用于猪、牛、羊的肝脏和肌肉，鸡肌肉，鸡蛋，牛奶中泼尼松、泼尼松龙、地塞米松、倍他米松、氟氢可的松、甲基泼尼松、倍氯米松、氢化可的松单个或多个药物残留量的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修定版均不适用于本标
3、准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法3制样3 1样品的制备3 1 1取新鲜或冷冻空白或供试组织，并使均质。3 1 2取适量新鲜或冷藏空白供试牛奶和鸡蛋样品。3 2样品的保存3 2 1组织样品20。C以下贮存备用。3 2 2牛奶和鸡蛋样品4。C以下贮存备用。4测定方法4 1方法提要或原理组织样品用碱水解，乙酸乙酯提取。牛奶和鸡蛋样品用乙酸乙酯提取，提取液用固相萃取柱净化高效液相色谱一串联质谱ESI负离子模式进行检测。42试剂和材料以下所用的试剂，除特别注明外均为分析纯试
4、剂，水为符合GBT 6682规定的一级水。4 2 1糖皮质激素类药物标准品。泼尼松，98；泼尼松龙，995；地塞米松，995；倍他米松，995；氟氢可的松乙酸盐，98；甲基泼尼松，995；倍氯米松，995；氢化可的松，995。4 22甲醇。1农业部1031号公告一220084 2 3正己烷。424乙腈：色谱纯。4 2 5乙酸乙酯。4 26丙酮。4 2 7甲酸。4 2 8氢氧化钠。4 2 9氢氧化钠溶液01moUL称取40 g氢氧化钠，用水溶解，稀释定容至1 000 mL。42 10正己烷一丙酮溶液(64，vv)。4 2 11流动相：A相：水；B相：乙腈(色谱纯)；C相：移取20 mL甲酸，用水
5、定容至1 000 mL，得到02甲酸水溶液。022 p“滤膜过滤，现配现用。4 2 12糖皮质激素类药物标准贮备液分别精密称取适量的糖皮质激素类药物标准品，用甲醇溶解定容，分别配制成1 000 pgmL的溶液作为贮备液。一20以下保存。4 2 13糖皮质激素类药物混合标准工作液准确量取糖皮质激素类药物标准贮备液适量，用20乙腈水溶液稀释成适宜浓度的混合标准T作液，现配现用。4 3仪器和设备4 3 1高效液相色谱串联质谱仪：配有电喷雾离子源(ESI)。4 3 2天平：感量oOl g。433分析天平：感量o。000 Ol g。4 3 4冷冻高速离心机(15 000 rmin)。4 3 5振荡器。4
6、36旋涡混合器。4 3 7组织匀浆机。4 3 8氮吹仪。4 3 9旋转蒸发仪。4 3 10固相萃取装置。4 3 11固相萃取柱。Silica柱：500mg6mL，或相当者。4 4测定步骤4 4 1试料的制备试料的制备包括：取供试样品均质，作为供试试料；取空白样品均质，作为空白试料。4 4 2提取称取组织试料(2o05)g于50 mL离心管中，加乙酸乙酯15 mL，漩涡混合，8 000 rrain离心2农业部1031号公告一2200815min，移取乙酸乙酯层。于残渣中加01molL氢氧化钠溶液10mL，混匀，加乙酸乙酯20mL，漩涡混合，200 rmin摇床振动15 min，8 000 rmi
7、n离心15 min，移取乙酸乙酯层。合并两次提取液，40旋转蒸至近干，加乙酸乙酯1 mI。和正已烷5 mL，溶解残渣，待净化。取牛奶试料(2o05)mL于50mL离心管中，加乙酸乙酯20mL，漩涡混合，200 rmin摇床振动15 min，8 000 rrain离心15 min。移取乙酸乙酯层，40旋转蒸至近干，加乙酸乙酯1 mL和正己烷5 mI，溶解残渣，待净化。称取鸡蛋试料(2005)g于50 mL离心管中，加乙酸乙酯20 mL，漩涡混合，200 rrain摇床振动15 min，8 000 rmin离心15 rain。移取乙酸乙酯层，40旋转蒸至近干，加乙酸乙酯1 mL和正己烷5 mL，溶
8、解残渣，待净化。4 4 3净化用正己烷6 mI。活化固相萃取柱，提取液过柱。用正己烷6 mL淋洗萃取柱，抽干，用正己烷丙酮(64，VV)6 mL洗脱。洗脱液50氮气吹干，加20乙腈水溶液05 mL，溶解残渣，转入15 mL离心管中，15 000 rmin离心20min，取上清液，过022 gm滤膜，供高效液相色谱一串联质谱法测定。4 4 4标准曲线的备制准确量取适量糖皮质激素类药物标准贮备液，用20乙腈水溶液配制成泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、地塞米松、倍他米松浓度为02 vgL、05 vgL、2 vgL、5 vgL、20”gL、50 ggL，倍氯米松和氟氢可的松浓度为04 vgL、1 vg
9、L、4 vgL、10 vgL、40 vgL、100 ngL，氢化可的松浓度为08 vgL、2 ugL、8”gI。、20 vgL、80 vgL、200 ugL的混合标准系列1二作液，依次进行测定，以得到的峰面积为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。4 4 5测定4 451液相色谱条件a)色谱柱：c18色谱柱，150mmX 21mm，粒径5“m，或相当者；b)流动相：A相：B相：C相，梯度洗脱程序见表1；c)柱温：40；d)进样量：20“L。表1 流动相梯度洗脱条件和流速时间，rain 流速，mLmin A相， B相， c相，0 0 20 65 30 517 020 65 30 52
10、0 020 45 50 524 020 45 50 524 1 O20 65 30 530 020 65 30 54 4 5 2质谱条件离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描；检测方式：选择反应监测；喷雾电压：4 000 V；离子传输管温度：330；鞘气压力：40 arb；辅助气压力：6 arb；糖皮质激素类药物选择反应监测的优化参数见表2。农业部1031号公告-22008表2糖皮质激素类药物选择反应监测的优化参数药物名称 英文名称 相对保留时间，min 定性离子对 定量离子对 Tube lensV泼尼松 68 403023269 4030326 9 20403 03572 11泼尼松龙
11、prednisolone 65 4050；329 0 4050；3290 224050；358 8 27氢化可的松 hvdrocortisone 68 40713311 407 1331 1 1640713611 11甲基泼尼松 methylpredrlisolone 135 419 02342 9 419 02342 9 19419 0；3731 16地塞米松。 dexamethasone 147 437 0；3610 437 0：361 0 154370239i5 10倍他米松 betamethasone 162 4370；3610 437 O3610 15437023915 10倍氯米松
12、 beclomethasone 20 9 4530；3768 453 024069 134530；406 9 13氟氢可的松乙酸盐 fludrocornsones 268 467124208 467124208 13acetate 467 1；349 2 26+地塞米松相对保留时间在倍他米松之前。4453液相色谱串联质谱测定取适量试样溶液和相应的标准溶液，单点校准，按外标法，以峰面积积分值定量，标准工作液及试样液中糖皮质激素类药物的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。在上述色谱条件下，标准溶液和试样溶液中的特征离子的质量色谱图见附录A。4 4 6空白试验取空白试料采用完全相同的测定步骤进行平行
13、操作。4 4 7定性与定量通过样品色谱图的保留时间与标准品的保留时间、各色谱峰的特征离子与相应浓度标准品各色谱峰的特征离子相对照定性。样品与标准品保留时间的相对偏差不大于5；样品特征离子的相对丰度与浓度相当混合标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表3的规定，则可判断样品中存在相应的被测物。表3定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度 50 20至50 10至20 10允许的相对偏差 士20 土25 30 土50将供试试样和标准溶液的定量离子面积之比作单点校正定量。4 5结果计算与表述试料中糖皮质激素类药物的残留量(,ugkg)按式(1)计算。 x一糌(1)式中：x试料中糖皮质激素
14、类药物的残留量，单位为微克每千克或微克每升(pgkg或ttgL)；A试样溶液中糖皮质激素类药物的峰面积；A，标准工作液中糖皮质激素类药物的峰面积；C，标准工作液中糖皮质激素类药物的浓度，单位为微克每升(“gL)；V溶解残余物所得试样溶液体积，单位为毫升(mL)w样品质量，单位为克(g)。注：计算结果需将空白值扣除。5检测方法灵敏度、准确度、精密度农业部1031号公告一2200851灵敏度泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、地塞米松、倍他米松在牛奶中的定量限为02 t-gL，肌肉和鸡蛋中定量限为05 ugkg，肝脏中定量限为1 ugkg；倍氯米松和氟氢可的松在牛奶中定量限为04tgL，肌肉和鸡蛋中定
15、量限为1 ugkg，肝脏中定量限为2 ugkg；氢化可的松在牛奶中定量限为08 ptgL，肌肉和鸡蛋中定量限为2 ugkg，肝脏中定量限为4 f_tgkg。5 2准确度本方法在牛奶中添加02 ugkg06 ugkg浓度时回收率为50120 ooo，在肝脏中添加1 pgkg4 pgkg浓度时回收率为601zo，在肌肉和鸡蛋中添加05 ttgkg15 ugkg浓度时回收率为50120。5 3精密度本方法的批间变异系数不大于20。农业部1031号公告一22008附录A(资料性附录)糖皮质激素类药物特征离子质量色谱图1。：|蝥!： 篓!：。，：。，| 硅 删。j-世一一一I翟：!二c篮 。”。1a礁：
16、型： 竖!兰：， 。帆，。j。礁：!： ! 竺 !：一L， 慨。，。帆，000 一m。m_一叩一以o 15 20Time(min)1 4671420 830图A 1 糖皮质激素类药物标准溶液特征离子质量色谱图(0 2斗gL)oollJ=；上oAI_农业部1031号公告一2200810：丑。 竺!： 兰坐_竺 =兰；丛。，。州。|：三 竺!： ：翌 ：!竺 ：兰；赳。，。，。00010 Time115 20 25图A 2空白猪肝脏特征离子质量色谱图1l翌! | 艟11l型 |-t墨R 1 40 一T： 1l ：垃! 10i|!兰竺兰! 兰! 兰! ：! 曲。j!兰 !：!：! 竺 竺 口f L竺
17、 nD斗一_呵叩m呵：k图A 3猪肝脏中糖皮质激素类药物特征离子质量色谱图(1 t,gkg)ltc，山AI葛百笛农业部1031号公告一220088。：|：墨!。：!。： !：!：!：! !：! ：!：，：!，。0：基堡垒墨篓鳖兰兰当当。100i_l 0100；趸0000I fl盖皇。竖：塞。竺当兰坚型兰0：j睦羔x兰L型_!墨上0000Time(rain)图A 4空白牛奶特征离子质量色谱图”：|监一止! 一一 一”l 口：10：k!止：1l型二 。： 。 竺誉王RT：00 1 丛! j 5 。I，”：|邀22上一：!L：一。 。|螳2：!一：!L一L：一。000 k叩一r_n呷m m：止nO
18、10 15Time(rain图A 5牛奶中糖皮质激素类药物特征离子质量色谱图(0 2L)；punqAI|目农业部1031号公告一220081l耋盛趟盆兰当蛰盔血。地。垫垒兰盟罂坷瑙些坠当蛰。眠。，瑚。10：啦丛筮遨盐釜-芷kn，100-3 1j2 5 。玉越一盏也篓垒a叁墨二。：纽。，。，。10：玉竺坚竺_!一竺!剑。”嘲。1a也竺竺J竺 堡!苎! ：翘o：j。：!生一!：!：!： !：! !：! d【100010 15 20 25Time(rain)图A 6空白肌肉特征离子质量色谱图10i|鲨 1： 蛳。1l上竺 ：帅1l裂。卫 川1l盛丑二竺盟竺：。：。1l ：姒 筌。妃。m1l型! n竺
19、：翌。，0406。|。盐! 一L竺翌。ss 。0000 5 10 15 20 25 30Time fminl图A 7肌肉中糖皮质激素类药物特征离子质量色谱图(0 5肛kg)8目PunqT互出8可口口乓ojo篮农业部1031号公告一22008质量色谱图中：1泼尼松的特征离子质量色谱图(40303269)；2泼尼松龙的特征离子质量色谱图(4050329o)；3氢化可的松的特征离子质量色谱图(40713311)；4甲基泼尼松的特征离子质量色谱图(41903429)；5地塞米松的特征离子质量色谱图(4370361o)；6倍他米松的特征离子质量色谱图(4370361o)；7倍氯米松的特征离子质量色谱图(45304069)；8氟氢可的松乙酸盐的特征离子质量色谱图(46714208)。
