1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/1618一2005李属坏死环斑病毒检测方法Detection of prunus necrotic ringspot virus 、一、一2005皿08-18发布060608000115 2006-02-01实施飞枣罗中华人民共和国发布国家质量监督检验检夜总局前言本标准的附录A为规范性附录，陆录B、蹄录C为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T 1618一2005本标准由中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所负责起草，中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国陕西出入境检验检疫局参加起幕。本标准主要起草人z李桂芬、李
2、明福、魏梅生、相宁、张永江、韩丽娟、魏迪功。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。I SN/T 1618-2005 李属坏死环斑病毒检测方法1 范围本标准规定了李属坏死环斑病毒检掘和鉴定的基本原则和方法。本标准适用于可能带有李属坏死环斑病毒的所有进境的无性繁盛材料、组培苗、种子和果实的检测和鉴定。2 原理2. 1 李窟坏死环斑病毒学名、分类地位学名:Pn日lUSnecrotic ringspot virus 缩写:PNRSV分类地位z雀麦花叶病毒科CBromoviridae)，等轴不稳环斑病毒属CIlarvirus)。2.2 寄主范围该病毒寄烹范围广泛，自然和实验接种侵染21科双子叶植物，
3、该病毒可侵染大多数字属植物、玫瑰、啤擂花。在人工接种的情况下还可侵染180余种植物。2.3 病害症状病害症状因分离物、栽培种和环境条件不同而不同。病毒的一些分离物不引起症状，仅仅在接种指示植物或用血清学等方法检测时才能发现被侵染;一些分离物在系统侵染的当年在幼叶上产生坏死斑和孔洞，但在以后的年份里，在叶子和果实上很少出现症状;另一些分离物在侵染当年产生坏死反应，随后是慢性的褪绿叶斑驳和坏死、叶子耳突、畸形、延迟水果成熟，水果上有斑点症状。如在甜樱桃上出现了从无症状到严重皱缩花叶症状，慢性症状包括叶子上的褪绿点、叶扭曲，水果延迟成熟凡天至几周，症状因病毒分离物不同而不同。在玫瑰上无症状侵染很普遍
4、，症状有花叶、开花延迟、秋天落叶早、产生更多不成形的花，被侵染的植株通常无活力。在啤酒花上产生褪绿线和环斑。2.4 分布地区广泛分布在温带地区，如欧洲各国和美自都有发生。2.5 传播方式机械接种传播、花粉传播、种子传播，也可通过元性繁殖苗木、组培苗的运输等人为途径进行长距离传播。2.6 粒体形态李属坏死环斑病毒粒体为等轴对称球状体，直径23nm27 nm，有些粒体为准等轴球状J短棒状轴比为1.011. 5);有些株系的病毒粒体量明显的棒状轴比大于2.2);有些棒状粒体达70nm。棒状粒体的有元及比例因株系而异。2. 7 病毒基因组正单链RNA，3分体基因组，RNA-1长3.662kb，RNA之
5、长2.507kb，RNA-3长1.887 kb o 3-仪器设备、周具及试剂3. 1 仪器设备酶标检扭tl仪、天平(1/10000 g)、PCR仪、电掠仪、电泳槽、紫外透射仪、隔离温室、榨汁机、水浴锅等。1 SN/T 1618-2005 3.2 用具可调移液器(200L-IOOOL、20L200L、0L-I0L、1000L-5000L)、可调移液器头、酶联板、eppendorf管、指型管、研钵等。3.3 试剂酶联检测试剂见附录A)、PCR检测试剂(见前录白。4 病毒检测采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法见附录A)、生物学测定(见附录C)、RT-PCRC见酣录B)检测方法进行检测。5 结果判定样品
6、酶联检测为阳性，RT-PCR检测为阳性或生物翻定鉴别寄主反应与附录C描述相吻合，即可判断为李属坏死环斑病毒。6 样品保存和复核6. 1 样品保存鉴于李属坏死环斑病毒为检疫性有害生物，样品应保存在适合的条件下以备复核。如组培苗应保存在纽培室中，生长苗木应保存在隔离温室中，种子应保存在干燥条件下。6.2 结果记录与资料保存完整的实验记录要包括:样品来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和实验人员的主要字。生物学测定需有鉴别寄主的症状照片，双抗体夹心酶联免疫吸附测定法检测需有酶联板反应的照片，RT-PCR检测需有电泳结果照片。6.3 复核由国家质量监督检验检疫局指定的单位或人
7、员负责，主要考察实验记录、照片等资料的完整性和真实性，必要时进行复核实验。2 A.1 试剂A. 1. 1 包被缓冲撞CpH9.6)碳酸铀CNa2COa)碳酸氢锵CNaHCOa)叠氮化铀CNaNa)用蒸锚水定容至1L。A. 1.2 PBST接冲溜CpH7.4)氧化铀CNaCD磷酸二氢怦CKH2P04)硝酸氧二铀CNa2HP04)氧化饵CKCDTween-20 叠氮化铀CNaNa)用蒸馆水定容至1Lo A. 1.3 样品抽提缓冲液PBST 亚硫酸铀CNa2S0a)PVP A. 1.4 酶标抗体稀释援冲滚PBST PVP BSA A. 1. 5 底物援;中液二乙酶胶蒸馆水甜录A(规范性附录)双抗体夹
8、心酶联免瘟破附测定法1. 59 g 2.93 g 0.20 g 8.0 g 0.2 g 1. 15 g 0.2 g 0.5 mL 0.2 g 1L 1. 3g 20 g 1L 20 g done 2.0 g 97 mL 600 mL 用盐酸调pH值至9.8，然后用蒸锢水定容至1Lo A.2 实验步骤SN/T 1618 2005 A.2.1 按要求的浓度和需要的体积用钮被缓冲液稀释包被抗体，每孔加100L。酶联板加盖或用保鲜膜包好，放在370C赔育2h。A.2.2 清空酶联板孔中溶攘，用PBST加满各孔，3min后倒掉孔中洗涤蔽，在吸水纸上拍干，再重复两次。A.2.3 待检样品按1:C210)
9、C质量浓度)加入样品抽提缓冲液，在研钵中研磨，低速离心，吸取上清液100L/孔，每个待检样品应设重复，设阳性对照、阴性对照、缓冲液对照。加盖或用保鲜膜包好，40C癖育过夜或370C赔育4h。A.2.4 清空孔中溶液，先在自来水下冲洗3次;然后用PBST加满各孔，3min后倒掉，在吸水纸上拍干，再重复2次。3 SN/T 1618-2005 A.2.5 用酶标抗体稀释缓冲被按要求稀释酶标抗体，每孔加入100L，加盖或用保鲜膜包好，370C瞬育4ho A. 2. 6 阔步骤A.2.4洗板A.2.7 按1mg/mL的浓度将NPPC对础基苯磷酸铀)溶于底物溶液中(使用前配制并注意避光以防变色)，制成底物
10、溶液。每孔如人100LJ蔚物溶滚。加盖或用保鲜膜包好，室温避光脚育30min 60 mino A.2.8 酶联仪405nm波长下检查各孔的吸收值。A.3 结果判断A. 3.1 如果是商品试剂盒，根据试剂盒的说明来判勤。A.3.2 对照孔的OD峭值(缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔)，应该在质量控制范围内，即:缓冲液孔和阴性对照孔的OD405值小于0.15，当阴性对照孔的OD4Q5值小于0.05时，按0.05计算。阳性对照OD削值/阴性对照OD405值大于510;孔的重复性基本一致。A.3.3 在满足了A.3.2质量要求后，结果原则上可判断如下z样品OD峭值/阴性对照OD405值明显大于2，判为阳
11、性。样品OD削值/阴性对照OD峭值在阔值陆近，判为可疑样品，需重新做一次，或用其他方法加以验证。样品OD405值/阴性对照OD405值明显小于2，判为阴性。A.3.4 若满足不了A.3.2质量要求，则不能进行结果判新。4 B. 1 试剂B. 1. 1 抽提缓冲撞附录B(资料性附录)RT-PCR检测方法SN/T 1618-2005 称取6.05g Tris，溶于800mL蒸锚水中，分别如入10g SDS、5.64g氧化铀和3.72g EDTA，用浓盐酸调至pH7.0，加蒸锚水定容至1L，分装后离蓝灭菌。使用前加入琉基乙酶终浓度0.2%)。B. 1.2 3 mol/L醋酸铀(pH5.2)称取408
12、.1g含3个分子结晶水的乙酸铀，溶于800mL蒸锚水中，用冰乙酸调至pH5.2，定容至1 L，分装高压灭菌。B. 1.3 50 X TAE Tris 242 g 冰醋酸52.1 mL EDTA锅.2H20 37.2 g 加蒸铺水至1L。用时加蒸馆水稀释至1XTAEoB. 1.4 6 X加样缓冲波0.25%澳酣蓝40%(质量浓度)蔚糖水溶液B. 2 实验步黯B.2.1 样品处理B.2. 1. 1 将植物材料置于eppendorf管中，液氮冷冻，研碎。B.2. 1. 2 按19:3mL比例悬得于抽提缓冲液中，继续研磨。B.2. 1.3 再加人等体积的水饱和酣z三氯申烧z异戊醇(25: 24 : 1
13、)，棍匀。B.2. 1. 4 13 000 r/min离心5min，取上清蔽。B.2. 1. 5 加入1/10体积的3mol/L醋酸锅(pH5.2)，2.5倍体积的元水乙薛，一80.C30min以上(或一20.C过夜)。B. 2. 1.6 13 000 r/min离心15min，留沉淀。B. 2. 1.7 加入适量的75%酒精洗涤。13000r/min离心2min，弃上清，重复一次，风干得到样品。B.2.2 51物合成序列为:C5375 人ACGCGCAAAAGTGTCGAAATCT AAA-3 H83 5人TGGTCCCACTCAGAGCTCAACAAAG-3 RT-PCR产物大小为455b
14、p。B.2.3 反转录PCR(RT-PCR)B. 2. 3.1 DNA的合成待检甜核酸2L，20pM引物C5371L，双蒸水7L，88.C水浴10min，置于冰上，加入10mmo1/L dNTP 1L，40 U/L RNAsin o. 5L，5倍M-MLV反转录酶缓冲液4L，100mmol/L DTT 2L， 200 U/p.L M扎在LV反转录酶1L，混匀，42.C水浴1h，合成cDNA。B. 2. 3. 2 PCR扩增10 mmol!L dNTP 1L，20 pmol/L引物C5371L，20pmol!L引物H831L，10倍PCR缓冲液5 SN/T 1618-2005 5 !lL , c
15、DNA 2L，双蒸水39L，88.C10 min，加2U/!lL Taq酶1L，进行如下热循环:94.C3 min, 60.C1 min, 72.C 1 min，l次循环;94.C40 s ,60.C 1 min,72.C 1 min，35次循环，72.C10 min. PCR产物在1.5%琼脂糖电泳分离创澳化乙键染色。B.2.4 琼脂糖电珠B. 2. 4. 1 制备凝胶将1XTAE和电泳级琼脂糖按1.5%配好，在水浴中熔化混匀，冷却至55c左右。B.2.4.2 加漠化乙链澳化乙键浓度为O.5g/mL，与制备的凝跤混匀，倒入已封好的凝跤平台上，插上样品梳。B.2.4.3 加电珠溜待凝肢凝固后，
16、从制胶平台上除去封带，拔出梳子，加入足够量的1XTAE(缓冲液没过凝胶表面约1 mm)。B. 2. 4. 4 加样用适量的约2L3L)6X加样缓冲被分别与10L样品混合，然后分别将制备好的加样样品和适合的DNA分子量标准物加入样品孔中。B. 2. 4. 5 电球接通电源使DNA向南极移动，电压75V，电泳时间为1.5 h. B. 2. 4. 6 结果观察电泳结束后，将整个胶置于紫外透射仪上观察。B.3 结果判断通过观察，若在455bp左右处有条带出现，即可判断为阳性。6 C.1 试材C. 1. 1 鉴别寄主附录C资料性附褒)生物学测定SN/T 1618-2005 采用黄瓜CCucumis sa
17、ti vus )、胶苦瓜CMomordicabLsamina)、瓜豆CCyamo psis tetragonoLoba)、民本樱花CPrunusnionica shirofugen品种)、昆诺阿黎CChenoodiumquinoa)为鉴别寄主。C. 1.2 试剂1%磷酸盐缓冲液CpH7.4)、硅藻土。C.2 方法C.2.1 研磨病样加1: 1的磷酸盐缓冲液，在研钵中研碎。研碎后放入硅藻土，浓度为0.5%，与病、汁破1昆匀。C.2.2 接种用于将病汁液轻轻涂抹于鉴别寄主叶表匾。C.2.3 冲洗用自来水冲洗叶表面。C.2.4 标记做好标籍，置于隔离温室中。C.2.5 观察每天观察记载寄主反应。C.
18、3 鉴别寄主症状黄瓜z侵染初期具有清晰的褪绿病斑，系统死顶，继丽严囊矮缩和密生腋芽。肢苦瓜z初期产生坏死斑，偶见系统坏死。瓜豆z黑色的大病斑，系统叶脉坏死。日本樱花SHIROFUGEN品种:嫁接了带毒的芽之后，出现局部坏死和流胶症。昆诺阿黎z接种4d5 d，接种叶出现褪绿斑驳，新生叶系统斑驳死顶。goNiEH在中华人民共和国出入境检验检疫行业标准李属坏死环斑病毒检测方法SN/丁1618-2005争夺中国标准出版社出版发行北京复兴门外三星河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷争夺字叶聊小u次数一字第月俨hu-ani啕i0年张白白町-m开本880X 1230 1/16 2005年11月第一版当e定价8.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533书号:155066 2-16464
