1、ICS 65120B 46 缮雪中华人民共和国国家标准GBT 21 1042007动物源性饲料中反刍动物源性成分(牛、羊、鹿)定性检测方法PCR方法Identification of Ruminantia derived materials(Bovidae、Caprinae、Cervus)in animal。origi【nated feedstuffs-PCR method20071024发布 200804-0 1实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局劣龠中国国家标准化管理委员会仅111前 言GBT 21 1042007本标准的附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫
2、总局提出。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。本标准主要起草人：吴亚君、陈颖、徐宝梁、王晶、高宏伟、宗卉、曹际娟、黄文胜、袁飞、赵贵明。本标准首次发布。动物源性饲料中反刍动物源性成分(牛、羊、鹿)定性检测方法PCR方法GBT 21 10420071范围本标准规定了动物源性饲料中反刍动物(Ruminantia)源性成分(牛、羊、鹿)检测的PCR方法，该检测方法的检出限为01(质量分数)。本标准适用于动物源性饲料中反刍动物源性成分(牛、羊、鹿)的
3、定性检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB 6682分析实验室用水规格和试验方法GBT 146991饲料采样(GBT 146991 2005，IS0 6497：2002，IDT)SNT 1193基因检验实验室技术要求3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。31聚合酶链式反应polymerase chain reaction；PCR用于扩增位于两段已知序列之
4、间DNA(deoxyribonucleosidea acid，脱氧核糖核酸)的方法。模板DNA经过高温变性成单链，在DNA聚合酶和适宜的温度下，两条互不互补的寡核苷酸片段即引物分别与模板DNA两条链上的一段互补序列发生退火，接着在DNA聚合酶的催化下以4种dNTP(deoxyribonucleoside triphosphate，脱氧核苷酸三磷酸)为底物，使退火引物得以延伸，如此反复变性、退火和DNA合成这一循环，使位于两段已知序列之间的DNA片段呈几何倍数扩增，经25个30个扩增循环，扩增倍数达到约106。4原理利用裂解液破碎细胞，三氯甲烷抽提蛋白质，无水乙醇沉淀得到DNA；以提取的DNA为
5、模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物；PCR阳性产物应用限制性内切酶酶切反应进行确证。5试剂和材料除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB 6682的要求。51 反刍动物源性成分检测用引物(对)序列为：F 1 5一TTTGGTCCCAGCCTTCCTGTT-3R：5CTTAGTCAAACTTTCGTTT一352 TaqDNA聚合酶(Taq，Thermus aquaticu，水生栖热菌)。53限制性内切酶：AluI酶。1GBT 21 104200754 dNTPs：dATP(deoxyadenosine triphospbate，脱氧腺苷三磷酸)、dTTP(deox
6、ytbymidine triphosphate，脱氧胸苷三磷酸)、dCTP(deoxycytidine triphosphate，脱氧胞苷三磷酸)、dGTP(deoxyguanosinetriphosphate，脱氧鸟苷三磷酸)。55琼脂糖：电泳纯。56溴化乙锭。57三氯甲烷。58无水乙醇。59 70乙醇。510 DNA分子量标准品(100 bp600 bp)(bp：base pair，碱基对)。51 1裂解液：1CTAB(cetyhrithylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵)，005 molL TrisHCI(pH8o)Tris一：tris(hydroxymethyl
7、)aminomethane，三(羟甲基)氨基甲烷，07 molL NaCI，001 molL EDTA(pH80)(ethylene diaminetetraacetic acid，乙二胺四乙酸)。512 TE缓冲液(Tris HCI、EDTA缓冲液)：10 mmolL Tris_Hcl(pH80)，1 mmolL EDTA(pH80)。513 10PCR缓冲液：100 mmolL KCl，160 mmolL(NH4)2S04，20 mmolL MgS04，200 mmolLTris-HCl(pH88)，1Triton X 100(t-octyiphenoxypolyethoxyethano，
8、辛基苯氧基聚乙氧乙醇)，1 mgmL BSA(bovine serum albumin，牛血清蛋白)。514电泳缓冲液：Tris 54 g，硼酸275 g，05 molL TE缓冲液(pH80)20 mL，加蒸馏水至1 000 mL；使用时10倍稀释。515溴化乙锭贮存液；用水配制成10 mgmL。516加样缓冲液：025溴酚蓝，40(质量浓度)蔗糖水溶液。517酶切缓冲液：10mmolLTfisHa(pH75)，10mmolLMgCl2，50retoolLNaCl，01mgmLBSA。6仪器设备61 DNA热循环仪。62核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。63恒温水浴锅。64离心机：离心力12
9、000 g。65 微量移液器(o5 pL10弘L，10 pL100 pL，10 pL200,uL，100弘L1 000 pL)。66电泳仪。67紫外检测仪。68 pH计。69天平：感量001 g。7试样选取与制备按照GBT 146991采样，将实验室样品粉碎，充分混合均匀后待用。8检验步骤81样品的总DNA提取样品粒度100目时最少称取50 mg；60目最少称取100 mg；20目最少称取200 mg。称取样品于微量离心管中，加入600 pL800 pL裂解液，65C 3 h，期间不时振荡混匀；12 000 g离2GBT 211042007心5 min；转移上清于洁净离心管中，加等体积酚，混匀
10、；12 000 g离心5 mln，取上清液，加等体积三氯甲烷+异戊醇(24十1)，混匀；12 000 g离心5 min，取上清液；加2倍体积冰预冷的无水乙醇，一20沉淀1 h；12 000 g离心5 min，小心弃上清液；70乙醇洗涤一次，晾干；加入50 pL TE，溶解沉淀。也可用等效DNA提取试剂盒提取模板DNA。82 DNA浓度和纯度的测定取5 gL DNA溶液加双蒸水稀释至1 mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260 nm和280 nm处的吸光值A。6。和A。DNA的浓度按式(1)计算：cAN501 000 (1)式中：cDNA浓度，单位为微克每微升(19zL)；A260
11、 nm处的吸光值；N核酸稀释倍数。当A260A。$。比值在1719之间时，适宜于PCR扩增。83 PCR扩增50 pL反应体系：10PCR缓冲液5 pL、dNTP(5 mmolL)1zL、引物对(各5,umolL)2 pL、TaqDNA聚合酶3 U、模板DNA 100 ng50 ng。一般反应程序：94 0C预变性5 min，94 0C变性30 S，55C退火30 S，72 0C延伸30 S，30个循环。72 0C延伸5min。4保存。检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。用已知含反刍动物源性成分的样品作阳性对照，用已知不含反刍动物源性成分的样品作阴性对照，用等体积的双蒸水代替模板DN
12、A作空白对照。84 PCR扩增产物电泳检测取2 g琼脂糖，于100mL电泳缓冲液中加热，充分熔化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为05,gn1L，制胶。在电泳槽中加人电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。将5zL8zL PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样。9 Vcm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部。紫外检测仪下观察电泳结果并记录。85限制性内切酶酶切及产物电泳检测如果PCR扩增产物电泳检测结果阳性，进行限制性内切酶酶切反应。反应体系(20 pL)：AluI酶2 U，酶切缓冲液2 pL，加入PCR扩增产物至总体积20 pL。酶切在37下进行，2 h。酶切完成后电泳，方法见84。9结果判断
13、与表述91 PCR扩增产物电泳检测结果牛、鹿PCR扩增产物为202 bp(序列参考附件A)；羊PCR扩增产物为206 bp(序列参考附件A)。92 限制性内切酶酶切电泳检测结果牛PCR产物采用内切酶AluI酶切后，酶切片段大小为97 bp，80 bp和25 bp；羊PCR产物采用内切酶AluI酶切后，酶切片段大小为125 bp和81 bp；鹿PCR产物采用内切酶AluI酶切后，酶切片段大小为97 bp，81 bp和24 bp；牛、羊、鹿PCR产物混合物采用内切酶AluI酶切后，酶切片段大小为125 bp，97 bp，81(80)bp，25(24)bp。93结果表述PCR产物为阳性，同时酶切结果
14、符合92中任何一种酶切模式者判为含有反刍动物源性成分，表3GBT 211042007述为检出反刍动物源性成分；PCR产物为阴性者判为不含有反刍动物源性成分，表述为未检出反刍动物源性成分。10检测过程中防止交叉污染的措施按照sNT1193执行。11废弃物处理检测过程中的废弃物，收集后在焚烧炉中焚烧处理。4附录A(资料性附录)PCR产物测序结果GBT 21 1042007TTTGGTCCCAGCCTTCCTGTTAACTCTTAATAAACTTACACATGCAAGCATCTACACCCETTTGGTCCCAGCCTTCCTATTGACCITTAATAGACTTACACATGCAAGCATCCAC
15、ACTCCTTTGGTOCCAGCCTTCCTGTrAACr兀AAl、AGACrIXrACATGCAAGCAr(ACGOCCCAGTGAGAAIGCC(xTAGGTTATTAAAACTAAGAGGAGCTGCEATCAAGCACACACCCKGIGkkGCCCICc氏氏GtlKATAAAACCAAGAGG氏GCIGG飞K【cKhGChCKCATCCe1G沁弧KGcC哪CGK甄c睑氏e撼bCI4 jCC械K禹忑缸cK吼瓯随憾IeFGZ4GC心f)6鼻。黜，脱7硝4CCACACCCCACGC辩AAACAGCAGTGACAAAJ?、一G掰GC劂吲C40F，脱心G吲(秘CCCCCACGGGAGACAGCAGT6月硝A4d硝门j7丁G工蹲GC丁翻(秘A030刀了8C力爿Ao翻(秘D奠删。爿；础G4翻(Z并G乃翻(搿屯44，丁AAGCCATAAACGAAAGTTTGACTAAG 202AAGCCATAAACGAAAGTTTGACTAAG 202AAGCCATAAACGAAAGTTTGACTAAG 2065牛鹿羊牛鹿羊牛鹿羊牛鹿羊
