1、ICS 65020B 16 圆园中华人民共和国国家标准GBT 24828-2009穿刺根腐线虫检疫鉴定方法Methods for quarantine and identification of Pratylenchus penetrans20091215发布 2010-06-01实施宰瞀徽霄黼譬燃瞥霎发布中国国家标准化管理委员会“”3目U 吾GBT 24828-2009本标准的附录A、附录B均为规范性附录。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中国检验检疫科学院。本标准主要起草人：戚龙君、葛建军、宋绍祚、孙红、郑建中。范围穿刺根腐
2、线虫检疫鉴定方法本标准规定r对穿刺根腐线虫检疫和鉴定方法。本标准适用于花卉、观赏植物、蔬菜、烟草、果树、豆科、禾本科等多种植物根部和土壤及栽培介质巾的穿刺根腐线虫。2鉴定依据穿刺根腐线虫英文名：RootLesion Nematode学名：Pratylenchus penetrans(Cobb，l 91 7)FilipjevSchuurmans Stckhoven，1 941异名：Tylenchus penetrans Cobb，1917Anguillulina(Pratylenchus)penetrazTs(Cobb)Goodey，l 932Tylenchus gulosus Kfihn，18
3、90Pratylenchus gulosua(Kuhn)FilipevScbuu rmans Stekhovcn194 1分类地位：线虫门(Nemala)、侧尾腺纲(Secernenlca)、垫刃目(Tylenchida)、根腐线虫科(Fraly1enchidae)、根腐线虫属(Pratylenchu*)穿刺根腐线虫是一种根部迁移性内寄生线虫，被侵染的植株呈现如下特征：a)地上部分表现为生长不良，发生矮化、褪绿，过早凋萎甚至死亡，产量减少；b) 地下部分引起根部变褐色、坏死，根茎和块茎往往也会遭受侵害；c)幼虫和成虫都可以侵入寄主根部组织，在病痕区和健康组织的交界处可见各个发育阶段的线虫。该线
4、虫危害350多种植物主要分布在温带地区。它的形态学特征是该检疫鉴定方法的依据。3仪器、用具31生物显微镜(40以上)。32生物体视显微镜(10以上，具透射光源)。33电热恒温箱。34载玻片和凹玻片。35盖玻片。36分样筛(100目、500目)。37烧杯(500 mL、l 000 mL)。38漏斗。39漏斗架。310乳胶管或硅胶管。311止水夹。312小镊子。313剪刀。314挑针。315浅盘。316线虫滤纸或卫生纸。GBT 24828-2009317酒精灯。318钟面皿或培养皿。319加热板。320干燥器。321试管。4药品41中性树胶。42 4甲醛。43指甲油。44乳酚油(苯酚20 mL、乳
5、酸20mL、甘油40mL和蒸馏水20mL混合而成)。45石蜡。5现场检疫51抽样511抽样方法棋盘式、五点式或随机抽样。512抽样数量按总件数的520抽样，最低抽检10件且不少于500株(个)。采集样品数量见表1。表1采集样品数量表总株(个)数，N 采集样品株(个)数N50 551N200 1 0201l 000 1 51 001N5 000 205 00lN10 000 25N10 000 在30的基础上，每增加5 000株(个)增取5株(个)52外观症状的检查521 对花卉、观赏植物、烟草、果树、蔬菜、豆科、禾本科等根茎部分进行检查，注意检查有否变褐和坏死等症状。522收集上述可疑根部材料
6、及所夹带的土壤或包装介质材料等和采集的样品一并送实验室进行穿刺根腐线虫的检验。6实验室检验61样品分离对于抽取的样品，仔细检查根部，尽量选取有变褐和坏死等症状的根及根围介质作为分离样品。62线虫分离用浅盘分离法或漏斗法分离线虫，详见附录A。63体视显微镜检查分离获得的水样在生物体视显微镜下检查。64显微镜检查挑取线虫若干条制成临时玻片在生物显微镜下镜检，观察线虫的形态结构。ZGBT 24828-20097形态鉴定特征71 根腐线虫属形态鉴定特征71，1雌雄虫共同特征a)雌雄同型，蠕虫状；体环明显，虫体粗短(体长300 pm900 pm)；b)头部低平(高度通常小于头基环直径的二分之一)，有2个
7、4个唇环，头部连续到略缢缩，头架骨化显著；c) 口针粗短，长u izm22 IJm，基部球发达；d)背食道腺开I：_l位于口针基部球后约2 Iml4 izm。食道腺叶短，从腹面和侧面覆盖肠前端；e)侧区有4条8条侧线，通常有4条。712雌虫单生殖腺、前伸，后阴子宫囊通常短于2个阴门处体宽。尾长是肛门处体宽的2倍3倍，尾圆锥形，末端钝圆(很少尖)。713雄虫交合刺骨化、稍弯，引带不伸出泄殖腔，交合伞延伸到建端。72根腐线虫形态鉴定特征721测计值穿刺根腐线虫的测量数据见表2。表2穿刺根腐线虫测计值722形态描述7221雌虫a)热杀死时虫体近直线形，虫体中等大小，体表环纹较细，侧线四条，中食道球近
8、圆形，宽度为该处体宽的一半。食道腺从腹面覆盖肠的前端，覆盖长度为301m40”m。排泄孔约在食道一肠交界的相对位置上，离虫体前端74 pm101zm处，见图1中的I；b) 头架发达，唇区稍高，稍缢缩，唇环三个，口针基部球宽圆形，背食道腺开口在口针基部球2 5,um，见图1中的B；c)受精囊近圆形，内充满精子，宽为该处体宽的三分之二。阴道直且短，长约为阴门处体宽的四分之一。后阴子宫囊短，长约为阴门处体宽的1倍15倍。肛门与阴门的距离约为尾长的25倍，见图l中的c；d)尾近圆筒形，末端光滑(偶尔有一个至两个线纹)，尾腹面有15条27条体环，见图1中的D、E。72，22雄虫a) 与雌虫体形相似，普遍
9、发生，见图l中的A、H；b)侧线四条，排泄L约在离虫体前端66 pm79 pm处，见图1中的H；c)交合刺骨化略成弓形，长为14 gm 17 pm；引带长为39 pm42 pm；交合伞包到尾端，见图1中的F、G。3GBT 24828-2009A 雌虫头部；B雄虫头部；c雌虫阴门区和尾D，E 雌虫尾端；F 雄虫尾部腹面；G 雄虫尾部侧面；H 雄虫整体；I 雌虫整体。图1 穿刺根腐线虫形态特征(仿Corbett，1973)8结果判定符合第7章形态特征的可鉴定为穿刺根腐线虫。鉴定过程应注意该线虫与咖啡根腐线虫、伤残根腐线虫和卢斯根腐线虫的形态区别，四者的主要区别见表3。表3 四种主要根腐线虫的主要形
10、态区别对照表口针长度 后阴子宫囊根腐线虫种 唇环数 侧线数 受精囊形状 尾形 长度肛m】倍15倍穿刺根腐线虫3 1 517 4 近圆形 锥形，末端钝闻、无纹阴门处体宽咖啡根腐线虫 2 1518 4(个别5条6条) 长卵圆形 砸园柱形、末端无纹 1750伤残根腐线虫 34 1319 4 长椭圆形 锥形，尾尖细同 zI64卢斯根腐线虫 2 1418 4(个别5条6条) 长卵形 锥形，尾端无纹、钝尖 18269样品保存91若鉴定为穿刺根腐线虫，则将剩余的线虫杀死、固定制成永久玻片保存，制作方法详见附录B；也可以同定后放人含4甲醛液的指形管内长期保存。92对已鉴定出带有穿刺根腐线虫的植物材料，经登记后
11、，要保存在510及干燥、防鼠防虫处，并标明样品编号、截获日期、截获人、寄主名称、运输工具名称、输出国名等，样晶需至少保存6个月，以备复验、谈y-0和仲裁。GBT 24828-2009A1漏斗法附录A(规范性附录)穿刺根腐线虫的分离法首先将10 CITI 15 cm直径的漏斗固定在支架上(见图A1)，柄端接一段乳胶管，管的近末端用止水夹夹紧。将分离的样品先剪成小块，用纱布包好，放人漏斗，加水淹没。分离土壤中的线虫，在漏斗内加一只不锈钢或塑料的网，将纱布铺在筛网上，再放入样品。在线虫自身的趋水性和重量作用下线虫不断脱离植物组织和土壤等，穿过纱布迁游到水中，最后沉降到漏斗末端的乳胶管F端水中。24
12、h后，小心地打开乳胶管末的止水夹，用小器皿接取约5 mL的含有线虫的水样，放在生物体视显微镜下进行观察。用此法分离线虫时，室内温度最好要保持在2124，温度太高或太低均会影响穿刺根腐线虫的分离效果。l 精斗；2用纱布包裹的样品；3 乳胶管；4 止水夹。图A1 Baermann漏斗装置A2浅盘分离法浅盘分离法装置(见图A2)由两只不锈钢浅盘、线虫滤纸或卫生纸组成，两只浅盘可套放，E盘底面为大于10 H的粗筛网，下盘为正常浅盘。分离线虫时，将线虫滤纸平放在上盘的筛网上，用水淋湿，将供分离的已剪成小块的样品撒铺在其上，套进下盘内；从两只浅盘的夹缝中注水，以淹没供分离的样品为宜；在2l24下放置24
13、h后，线虫渐渐集中到下盘的水中；用烧杯收集浅盘中水，并将烧杯中的水连续通过100日和500目的筛网，将500目标准筛上的含线虫的残留物冲洗到培养皿中镜检。61 上盘2 下盘图A2浅盘分离装置附录B(规范性附录)穿刺根腐线虫玻片标本制作方法GBT 24828-2009B1线虫杀死在生物体视显微镜下，用线虫挑针挑取少量线虫放至凹玻片上的水滴中，使线虫位于水滴中央。手持凹玻片在酒精灯火焰上来回5 s6 s，使线虫恰好被杀死为止。杀死大量的线虫，可将线虫悬浮液放在试管中加等量的沸水杀死线虫。B2线虫固定少量线虫被杀死后，可用线虫挑针将线虫移至4甲醛液中同定。大量的线虫被杀死后，在线虫悬浮液中加等量浓度
14、双倍的固定液即可。B3临时玻片标本的制作以4甲醛液作为浮载剂，滴适量于载玻片上。用挑针将嗣定好的线虫移数条于浮载剂中，并使其完全沉F。浮载剂边缘均匀放置3 mrn5 mm长、直径与线虫体宽相近的玻璃纤维丝3根，加盖玻片。用滤纸吸去溢出的浮载剂，用指甲油封片。待指甲油于后再加封一次，可保存几天至数周。B4永久玻片标本的制作B41脱水采用乳酚油快速脱水法(Franklin&Goodey，1949)，把滴有乳酚油的凹玻片放在加热板上，加热至6570。将已固定l d以上的线虫挑人热的乳酚油中，继续加热2 min3 mia后，在生物体视显微镜F观察标本是否清晰。若不够清晰，继续在6570的加热板上加热片
15、刻至清晰(注意避免加热过度而损坏标本)。然后放在干燥器中12 h24 h，进一步去除水分后即可制片。B42制片将直径15 cm的打孔器在酒精灯火焰上加热后，插到蜡盘中蘸取少量石蜡，并迅速轻按于载玻片中央。待冷却后即形成一个蜡圈。在蜡圈内滴一小滴乳酚油(用量以盖上盖玻片后不外溢为宜)作为浮载剂，将已脱水的线虫数条挑人其中，排列整齐，并使其完全沉下。将与线虫体宽相近的3根3 mm5 111 T-13的玻璃纤维丝均匀置于浮载剂边缘，加盖玻片后，将载玻片移至6570的加热板上熔蜡，待蜡熔化后移至实验台上冷却。用指甲油封片，待指甲油干后再封一次。最后贴上标签，左边的标签写明样品号、寄主、截获门岸、产地、制作13期；右边的标签写线虫种名、线虫虫态及其数量。
