1、ICS 65.150 B 50 远望中华人民共和国国家标准GB/T 25877-2010 淀粉胶电泳同工酶分析Starch gel electrophoresis isozyme analysis 2011-01-10发布数码阳伪中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会2011-06-01实施发布目。吕本标准的附录A、附录B、附录C、附录D和附录E均为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国水产标准化技术委员会归口。本标准起草单位:中国海洋大学、黄海水产研究所。本标准主要起草人:高天翔、张岩、韩志强、肖永双、张辉。GB/T 25877-2010 I GB
2、/T 25877-2010 淀粉胶电泳同工酶分析1 范围本标准规定了淀粉胶电泳同工酶分析的试剂和材料、仪器、抽样、分析步骤及结果判定。本标准适用于常见淡、海水水生生物的水平凝胶电泳常见的同工酶分析。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修改版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 18654. 1-2008养殖鱼类种质检验第1部分:检验规则GB/T 18654. 2-2008养殖鱼类种质检验第2部分
3、:抽样方法3 原理利用同工酶所带电荷的不同与分子大小的不同，在电场作用下，凝胶中出现的同工酶迁移率不同，经催化、染色、扫描，获得各同工酶谱带、数目及吸收强度等，经比较分析，判定鱼类的遗传特性。4 试剂和材料除另有说明外，所有试剂均为分析纯或以上级别，水为蒸饵水或去离子水或相当纯度的水。4. 1 水解马铃薯淀粉。4.2 拧攘酸。4.3 乳酸。4.4 乙二胶四乙酸。4.5 乙二胶四乙酸二铀。4.6 苹果酸。4. 7 乳酸惶。4.8 磷酸氢二纳。4.9 磷酸二氢锅。4. 10 辅酶I。4.11 辅酶E。4.12 吩嗦甲醋硫酸盐。4.13 氧化硝基四氮瞠蓝。4.14 异拧朦酸三铀。4.15 6-磷酸葡
4、萄糖酸铀。4.16 乙醇。4.17 丙酣。4.18 -荼乙酸。4.19 -磷酸甘油。4.20 6-磷酸葡萄糖。4.21 山梨糖醇。1 G/T 25877-2010 4.22 固蓝RR盐。4.23 冰乙酸。4.24 盐酸。4.25 氢氧化锅。4.26 肝素。4.27 氧化候。4.28 3-氨甲基-吗啡琳。4.29 TC-7.0制胶缓冲液:配制方法见附录A。4.30 TC-8.0制胶缓冲液:配制方法见附录A。4.31 CAPM-6.0制胶缓冲液z配制方法见附录A。4.32 CAPM-7.0制胶缓冲液:配制方法见附录A。4.33 TC-7.0电泳缓冲液:配制方法见附录B。4.34 TC-8.0电泳缓
5、冲液配制方法见附录Bo4.35 CAPM-6.0电泳缓冲液:配制方法见附录Bo4.36 CAPM-7.0电泳缓冲液:配制方法见附录B。4.37 淀粉凝胶z配制方法见附录C。4.38 染色缓冲液z配制方法见附录D。4.39 染色液:几种常见同工酶染色液配制方法见附录E。5 仪器5.1 微量匀浆机。5.2 高速冷冻离心机(转速12000 r/min)。5.3 多用电泳仪。5.4 真空抽气机(泵。5.5 电炉或微波炉。5.6 割胶器。5. 7 多层滤纸。5.8 激光扫描仪。5.9 pH计:精度为0.01.5. 10 制胶模具。5. 11 染色盒。5.12 4.C冷藏冰箱。5. 13 低温冰箱:冰室温
6、度在一20.C以下。5. 14 恒温培养箱。5.15 分析天平:精度为0.0001 go 5. 16 电子天平:精度为0.1go 5. 17 摄影装置:数码照相机。6 抽样6.1 样品的抽样按GB/T18654.2-2008的规定执行。6.2 取样取样品组织1g2 g试样，于低温冰箱中(一25.C以下)保存;对于血液试样，加肝素抗凝，于4.C 2 冰箱中保存，备用。7 分析步骤7. 1 分析样品的制备GB/T 25877-2010 电泳前取0.3g左右样品放入1.5 mL离心管，加入等体积的蒸馆水或提取液后置于冰浴中研磨，研磨混合被置于冷冻离心机中，在40C、12000 r/min的条件下离心
7、直至上清液澄清，取上清液冷冻保存备电泳用。对于血液试样，待分离出血清后上样。7.2 凝胶制备凝胶制备见附录C。7.3 电泳步骤用手术刀在凝胶距离边缘三分之一(约2.5cm)处w开，用适当大小的滤纸片蘸取7.1制备的样品提取液(或直接用适当大小的滤纸片蘸取冷冻肌肉肉汁)插入切口中。上样完毕后，向电泳槽内加入电泳缓冲液，用滤纸搭盐桥，在4oC条件下以恒定电流(40mA)进行电泳，电泳时间依酶的种类而不同。7.4 染色、固定电泳结束后，用割胶弓将凝胶水平切割为1.3 mm厚的薄片，置于染色盒中，将配制好的染色液倒入染色盒后置于37oC的恒温箱中进行染色。待显色充分后，用7%的冰乙酸溶液终止反应。各种
8、酶的染色液配制方法见附录D和附录E。7.5 制干股片取染色后的凝胶放于大小合适的玻璃纸上，压制封膜，风干后编号保存。7.6 摄影、扫描用照相近视镜头对凝胶及其谱带照相，或用激光扫描仪对风干片电泳谱带进行扫描。7.7 结果分析7.7.1 酶位点与等位基因分析根据酶的结构组成和同工酶在组织中所表现的酶谱特征，确定每种同工酶的编码基因位点、多态位点的等位基因频率。7.7.2 群体遗传特异性多态位点比例(p)、平均杂合度观察值(Ho)、平均杂合度期望值(He)分别按式(1)、式(2)和式(3)计算:式中:P-一一多态位点比例;N1一一多态位点数;n 检测位点总数。式中:H。一二平均杂合度观察值;P =
9、N1/n X 100% (l-q;j) Ho=卢1n q;j-一-第t个位点上第j个等位基因的纯合基因型的频率;m;一一第i个位点上的等位基因总数;一-检测位点总数。. ( 1 ) . ( 2 ) 3 G/T 25877-2010 (1-qt) Hezz=1 L二1n 式中zHe -平均杂合度期望值;qij一一第t个位点上第j个等位基因的纯合基因型的频率;m一一第i个位点上的等位基因总数;n一一检测位点总数。8 结果判定8. 1 个体测定结果的判定按GB/T18654. 1-2008中6.1的规定执行。( 3 ) 将所有测定结果逐一与标准对照，凡符合或接近标准规定的，判定为合格;凡不符合标准，
10、或与标准规定有显著差异的，判定为不合格。8.2 样晶群体的判定根据8.1的判定结果，计算出被检样品合格品的百分比，用百分数表示。4 GB/T 25877-2010 A.l TC-7.0制胶缓冲液附录A(规范性附录)制胶缓冲液的配制三是甲基氨基甲:皖1.09 g，用蒸馆水溶解并用拧朦酸调至pH7.0，蒸馆水定容至1L。A.2 TC-8.0制胶缓冲液三是甲基氨基甲烧1.21g，用蒸锢水溶解并用拧朦酸调至pH8.0，蒸榴水定容至1LA. 3 CAPM-6. 0制胶罐冲撞拧攘酸0.42g，用蒸馆水溶解并用3一氨甲基一吗啡琳调至pH6.2，蒸懵水定容至1Lo A.4 CAPM-7.0制服缓冲液拧棱酸0.
11、42g，用蒸情水溶解并用3-氨甲基-吗啡琳调至pH7.0，蒸悟水定容至1L。5 GB/T 25877-2010 B. 1 TC-7.0电泳缓冲撞附录B(规范性附录)电泳缓冲液配制三是甲基氨基甲:皖16.35g，用蒸饱水溶解并用拧攘酸调至pH7.0，蒸馆水定容至1L。B.2 TC-8.0电泳缓冲液三起甲基氨基甲:皖20g，用蒸馆水溶解并用拧棱酸调至pH8.0，蒸馆水定容至1L。B. 3 CAPM-6. 0电泳缓冲液拧棱酸8.4g，用蒸锢水溶解并用3-氨甲基-吗啡琳调至pH6.2，蒸锚水定容至1Lo B.4 CAPM-7.0电泳缓冲液拧攘酸8.4g，用蒸悟水溶解并用3-氨甲基-吗啡琳调至pH7.0
12、，蒸馆水定容至1L。6 附录C(规范性附录)淀盼凝肢的配制G/T 25877-2010 加淀粉30g和制胶缓冲液254mL，在锥形烧瓶内混匀，加水定容至1L，加热至沸腾、完全溶解，抽气后注入制胶模具(见图C.l)中，冷却后，保鲜膜密封保存备用。图C.1制股模具示意图7 GB/T 25877-2010 D. 1 0.2 mol/L Tris-HCI ,pH8. 0 附录D(规范性附录)染色缓冲擅配制三是甲基氨基甲:皖24.22g，用蒸馆水溶解并用盐酸调至pH8.0，蒸馆水稀释至1Lo D.2 0.2 moI/L Tris-HCI,pH8. 5 三起甲基氨基甲皖24.22g，用蒸馆水溶解并用盐酸调
13、至pH8.5，蒸馆水稀释至1L。D.3 0.2 moI/L Tris-HCI ,pH9. 5 三是甲基氨基甲烧24.22g，用蒸馆水溶解并用盐酸调至pH9.5，蒸馆水稀释至1L。D. 4 O. 1 moI/L磷酸缓冲液，pH7.0磷酸氢二铀17.91g和磷酸二氢铀8.05g，蒸锚水溶解定容至1L。8 GB/T 25877-2010 附录E(规范性附录)常见同工酶的染色液配制方法常见同工酶的染色液配制方法见表E.l。表E.l常见同工酶的染色液同工酶英文名和缩写试剂浓度用量乙蹲(99%)99% 1 mL2 mL 乙蹲脱alcohol dehydroenase; Tris-HCl O. 2 mol/
14、L , pH8. 5 25 mL 氢酶ADH NAD基本保存溶液0.25% 25 mL PMS基本保存溶液0.5% 0.5 mL r甘泊磷酸200 mg 甘油画室-3glyceraldehyde-3-phosphate Tris-HCl 0.2 mol/L , pH8. 5 25 mL 磷酸脱dehydrogenase; 氢酶G3PDH NAD基本保存溶液0.25% 25 mL PMS基本保存溶液0.5% 0.5 mL 苹果酸250 mg 苹果酸脱malate dehydrogenate; Tris-HCl 0.2 mol/L ,pH9. 5 25 mL 氢酶MDH NAD基本保存溶液0.25
15、% 25 mL PMS基本保存溶液0.5% 0.5 mL 乳酸铿0.6 mg 乳酸脱lactate dehydrogenase; Tris-HCl 0.2 mol/L , pH8. 5 25 mL 氢酶LDH NAD基本保存溶液0.25% 25 mL PMS基本保存溶液0.5% 0.5 mL 异拧核酸三纳25 mg Tris-HCl O. 2 mol/L , pH8. 0 25 mL 异拧橡酸isocitrate dehydrogenase; NADP基本保存溶液0.25% 25 mL 脱氢酶IDHP 氯化筷1 mol/L 1. 2 mL PMS基本保存溶液0.5% 0.5 mL 氯化硝基四氮
16、瞠蓝10 mg 乙二胶四乙酸二锅盐100 mg 超氧化物superoxide dismutase; Tris-HCl 0.2 mol/L ,pH9. 5 25 mL 歧化酶SOD 乙酶2.5 mL PMS基本保存溶液0.5% 0.5 mL 蒸馆水20 mL 6磷酸葡萄糖酸纳50 mg 磷酸葡萄phosphoglucomutase; Tris-HCl 0.2 mol/L ,pH8. 0 25 mL 糖变位酶PG岛f氯化缓1 mol/L 0.4 mL 9 GB/T 25877-2010 表E.1 (续)同工酶英文名和缩写试剂浓度用主运NADP基本保存溶液0.25% 25 mL 磷酸葡萄phosph
17、oglucomutase; 葡萄糖-6磷酸脱氢酶25 U 糖变位酶PGM PMS基本保存溶液0.5% 0.5 mL 丙酣1 mL 固牢RR盐32 mg 醋酶esterase; EST 磷酸缓冲液0.1 moI/L ,pH7. 0 20 mL 乙蹲2 mL 茶乙酸1% 20 mL 苹果酸250 mg Tris-HCl 0.2 moI/L ,pH8. 5 25 mL 苹果酸酶malic enzyme; ME 氯化缓1 mol/L 1 mL NADP基本保存溶液0.25% 25 mL PMS基本保存溶液0.5% 0.5 mL 山梨糖醇125 mg 山梨薛sorbitol dehydrogenase;
18、 Tris-HCl O. 2 mol/L , pH8. 0 25 mL 脱氢酶SDH NAD基本保存溶液0.25% 25 mL PMS基本保存溶液0.5% 0.5 mL 葡萄糖6磷酸25 mg 6磷酸glucose-6-phosphate Tris-HCl 0.2 moI/L ,pH8. 0 25 mL 葡萄糖dehydrogenase; 脱氢酶G6PDH 氯化钱1 mol/L 0.6 mL PMS基本保存溶液0.5% 0.5 mL 10 OFON|hhNH阁。国华人民共和国家标准淀粉胶电泳同工酶分析GB/T 25877-2010 中* 中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045 网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销司岳印张1字数17千字2011年2月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2011年2月第一版 书号:155066. 1-41600定价18.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533GB/T 25877-2010 打印日期:2011年3月23日F002A
