1、GB/T 4789.30-2003 前画本标准对GB/T4789. 30-1994(食品卫生微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验进行修订。240 本标准与GB/T4789. 30-1994相比主要修改如下:一一按照GB/T1. 1-2000对标准文本的格式和文字进行修改。一一-修改和规范原标准中的设备和材料。培养基成分的含量，A.4.1氯化销5g改为20g , 对6.8小鼠的致病力试验作了修改。本标准自实施之日起.GB/T4789. 30-1994同时废止。本标准的附录A是规范性附录。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位:中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。本标准主要起草
2、人g白竟玉、付萍、李志刚、计融。本标准于1994年首次发布，本次为第一次修订。1 范围食品卫生微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验本标准规定了单核细胞增生李斯特氏菌的检验方法。本标准适用于食品和食物中毒样品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验。2 规范性引用文件GB/T 4789.30-2003 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 4789.28-2003 食品卫生微生物学
3、检验染色法、培养基和试剂3 设备和材料3.1 冰箱:4c -20C。3.2 恒温培养箱:30C土1C、24C土lC.3.3 恒温水浴锅:46C士1C。3.4 均质器或灭菌乳钵。3.5 显微镜:lOX100X.3.6 离心机:4000 r/min. 3.7 架盘药物天平:0g500 g.精度0.5g. 3.8 锥形瓶:100mL、500mL. 3.9 灭菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mLJ度)。3.10灭菌平皿直径90cm. 3.11 灭菌试管:16mmX160 mm. 3.12 离心管:30mmX100 mm. 3.13 灭菌注射器:1mL。3.14 单核细胞增生李斯
4、特氏菌标准株。3.15 马红球菌。3.16 小白鼠:16g18g。4 培养基和试剂4.1 含0.6%酵母浸膏的膜酷大豆肉汤(TSB-YE):见第A.1章。4.2 含0.6%酵母浸膏的膜路大豆琼脂(TSA-YE):见第A.2章。4.3 EB增菌液g见第A.3章。4.4 李氏增菌液(LB1.LB，):见第A.4章。4.5 三糖铁(TSl)琼脂2按GB/T4789. 28-2003中4.26、4.27。4.6 SIM动力培养基2见第A.5章。4. 7 血琼脂:GB/T4789.28-2003中4.6。241 GB/T 4789.30-2003 4.8 改良的McBride(MMA)琼脂见第A.5章。
5、4.9 硝酸盐培养基:GB/T4789. 28-2003中3.1704.10 缓冲葡萄糖蛋白陈水(MR和VP试验用):GB/T 4789.28-2003中3.4。4.11 糖发酵培养基:GB/T4789.28二2003中3.2。4.12 过氧化氢酶试验:GB/T4789. 28-2003中4.拢。4.13 1%盐酸丫咬黄溶液(AcriflavineHCD:见第A.4.2.1章。4.14 1%茶院酣酸销盐溶液(Naladixic acid) :见第A.4. 2. 1章。检验程序5 单核细胞培生李斯特氏菌检验程序见图10增菌分离培葬蝇蟠养小凰致病力试验协同悟血试验椿血试验七叶膏凰李糖 醇甘露醇过氧
6、化氢酶试验硝酸盐还匾试验MRIVP试验显微镜下现事运动革兰民矗色图1242 GB/T 4789.30-2003 6 操作步骤6.1 样品的收集及处理无菌取样品25g(mL)放灭菌均质器中加225mLEB和LB增菌液中，充分搅拌成均质。如不能及时检验，可暂存4C冰箱。6.2 增菌培养EB增菌液放300C土1C培养48h.LB，增菌液225mL放300C士10C培养24h.吸取0.1mL.加入10 mL L也增菌液中二次增菌。6.3 分离培养将EB增菌液和LB，二次增菌液分离于选择培养基MMA琼脂平板上，培养300C士10C48 h.挑选可疑菌落，用白炽灯450角斜光照射平板，李斯特氏菌的菌落为灰
7、蓝或蓝色./J、的圆形菌落。6.4 选五个以上的上述可疑菌落接种三糖铁(TSn琼脂和SIM动力培养基，培养于250C士OC.观察是否有动力，且成伞状或月芽状生长。一般观察2d7 d.阳性者可做下一步鉴定。6.5 纯培养将上述有动力、形成伞状者并在三糖铁琼脂培养基上层、下层的产酸而不产硫化氢的可疑培养物接种于膜酷陈大豆琼脂培养基(TSA-YE)上纯培养，做以下鉴定。6.6 染色镜检将上述可疑纯培养物做革兰氏染色并做湿片检查;李斯特氏商为革兰氏阳性小杆菌，大小为(0.4mO. 5m)X(0.5m2.0m)，用生理盐水和I成菌悬液，在油镜或相差显微镜下观察，该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。6. 7
8、生化特性将上述可疑菌做进一步的生化试验，单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特性及其种间的区别见表10表1单核细胞增生李斯特氏菌生化性状与有关菌的区别菌种溶血反应硝酸盐还原尿素酶MR-VP 甘露醇鼠李糖木糖七叶背单核细胞增生李斯特氏菌+ +1+ 十(L. monocytogenes) 绵羊李斯特氏菌十十1+ 十(L ivanovii) 英诺克李斯特氏菌(L. innocua) +1十V 十威尔斯李斯特氏菌+1+ V + 十(L. welshimeri) 西尔李斯特氏菌十+1+ 十十(L. seelgeri) 格氏李斯特氏菌(L. grayi) 十1+ 十默氏李斯特氏菌十+1一+ V 十(L. mu
9、rrayi) 注，V反应不定，十阳性s一阴性。243 GB/T 4789.30-2003 6.8 对小鼠的毒力试验将符合上述特性的纯培养物接种于TSB-YE中.30.C培养24h.离心，弃上清液，用0.85%灭菌生理盐水制备成浓度为10cfu/mL的菌悬液，取此菌悬液进行小鼠腹腔注射3只5只，每只0.5mL.观察小鼠死亡情况。致病株于2d5 d内死亡。试验时可用已知菌作对照。单核细胞增生李斯特氏菌、绵羊李斯特氏菌(L.ivanovii)对小鼠有致病性。6.9 协同溶血试验(cAMP)在血平板上平行接种金黄色葡萄球菌和马红球菌(R.呵ui)，在它们中两者之间垂直接种可疑李斯特氏菌，但不要触及它们
10、.30C培养24h48 h.检查平板中垂直接种点对溶血环的影响。靠近金黄色葡萄球菌接种点的单核细胞增生李斯特菌的溶血增强，西尔李斯特氏菌(L.seeligeri)的溶血也增强，而绵羊李斯特氏菌(L.ivanovii)在马红球菌附近的溶血增强。244 GB/T 4789.30-2003 附录A(规范性附录)培养基A.1 含0.6%酵母漫膏的颐酶臆大豆肉汤(TSB-YE)A.1.1 成分膜炼17 g 多价豚3 g 酵母膏6 g 氯化销5 g 磷酸氢二饵2.5 g 葡萄糖2.5 g 蒸馆水1000 mL A. 1. 2 制法将上述各成分加热搅拌溶解，调至pH7.2-7. 4.分装.121c灭菌15m
11、n，备用。A.2 含0.6%酵母膏展爵黯大豆琼黯(TSA-YE)A.2.1 成分膜炼多价陈酵母膏氯化纳磷酸氢二伺葡萄糖琼黯蒸馆水cegb jggg5JK 1365221 1000 mL A.2.2 制法将上述各成分加热搅拌溶解，调pH至7.2-7.4.分装.121c高压灭菌，备用。A.3 EB增菌液A.3.1 成分膜陈17 g 多价炼3g 酵母膏6 g 氯化销5 g 磷酸氢二饵2.5 g 葡萄糖2.5 g 蒸馆水1000 mL 盐酸丫睫黄15 mg/L 245 GB/T 4789.30-2003 茶睫嗣酸40 mg/L A. 3. 2 制法除荼驼黄和荼咙酣酸外，其余成分加热混合，调pH至7.2
12、7. 4 , 121 C 15 min高压灭菌。使用前加丫皖黄溶液15mg/L和荼咙酣酸溶液40mg/L，此两种成分要元菌配制或过滤除菌。A.4 李氏增茵液也息，LB，)A.4.1 成分膜陈5 g 多价陈5 g 酵母膏5日氯化铀20 g 磷酸二氢梆1. 35 g 磷酸氢二锅12 g 七叶营1 g 蒸馆水1000 mL A. 4. 2 制法将上述成分加热溶解，调pH至7.27.4，分装.121C15 min高压灭菌。A.4.2.1 李氏I液(LB，)225mL中加入g1%茶咬酣酸(用0.05mol/L氢氧化锦溶液配和d0.45 mL 1%盐酸丫睫黄(用灭菌蒸馆水配制)0.27 mL A4.2.2
13、 李氏E液(LB，)200mL中加入z1%茶院隅酸。.40mL 1%丫吭黄0.50 mL 无菌分装于10mL大试管中。A.5 改良的McBride琼脂(MMA)A.5.1 成分膜陈多价陈牛肉膏葡萄糖氯化纳磷酸氢二纳苯乙醇无水甘氨酸氯化程琼脂蒸馆水A. 5.2 $1J法5 g 5 g 3 g 1 g 5 g 1 g 2.5 mL 10 g 0.5 g 15 g 1000 mL 将上述成分加热搅拌混匀，调pH至7.27.4.分装.121C15 min高压灭菌，备用。246 A.6 SIM动力培养基A.6.1 成分膜陈多价陈硫酸铁镀硫代硫酸纳琼脂蒸馆水A.6.2 制法20 g 6 g 0.2 g 0.2 g 3.5 g 1000 mL 将上述各成分加热混匀，调pH7.2，分装小试管，高压灭菌121C15 min。GB/T 4789.30-2003 247
