1、ICS 07.100.30 C 53 中华人民共和国国家标准2008-12-03发布GB/T 4789.35-2008 代替GB/T4789. 35-2003 食品卫生微生物学检验食品中乳酸菌检验Microbiological examination of food hygiene Examination of lactic acid bacteria in foods 中华人民共和国卫生部也主中国国家标准化管理委员会x.1 IJ 2009-03-01实施GB/T 4789.35-2008 目。自本标准代替GB/T4789.35一2003(食品卫生微生物学检验乳酸菌饮料中乳酸菌检验。本标准与G
2、B/T4789.35-2003相比主要修改如下:将乳酸菌饮料中乳酸菌检验改为食品中乳酸菌检验); 将选择性分离培养基由改良TJA培养基(改良番茄汁琼脂培养基)改为MRS培养基;一一修改了原标准中生化试验部分;一一乳酸菌计数由倾注法修改为涂布法;乳酸菌的鉴定由必做项目修改为选作项目。本标准的附录A是规范性附录。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准由中华人民共和国卫生部负责解释。本标准负责起草单位:中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。本标准主要起草人:徐进、刘秀梅、杨宝兰、李志刚。本标准所代替标准的历次版本发布情况为:一-GB4789.35-1996、GB/T4789. 35-2003
3、。I GB/T 4789.35-2008 1 范围食品卫生微生物学检验食品中乳酸菌检验本标准规定了含乳酸菌食品中乳酸菌(lacticacid bacteria)的检验方法。本标准适用于含活性乳酸菌的固体、半固体和液体食品中乳酸菌的检验。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 4789. 34食品卫生微生物学检验双歧杆菌检验3 术语和定义下列术语和定义适用于
4、本标准。3. 1 乳酸菌lactic acid bacteria 一类可发酵糖主要产生大量乳酸的细菌的通称。与食品工业密切相关的乳酸菌主要为乳杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)和链球菌属(Streptococcus)中的嗜热链球菌(Streptococcus thermo philus)等。4 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下。4. 1 恒温培养箱:36oC士1C。4.2 冰箱:20C，.，50Co4.3 均质器及元菌均质袋、均质杯或灭菌乳钵。4.4 天平:感量O.1 g。4.5 元菌试管:18mmX180 mm、
5、15mmX100 mm。4.6 元菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度或微量移液器及吸头。4. 7 元菌锥形瓶:500mL、250mL。5 培养基和试剂5.1 API50CH生化鉴定试剂盒lu5.2 MRS(man rogosa sharpe)培养基:见第A.1章。5.3 MC(modified chalmers )培养基z见第A.2章。5.4 0.5%煎糖发酵管:见第A.3章。5.5 0.5%纤维二糖发酵管:见第A.3章。1) 由法国生物梅里埃公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可
6、使用这些等效的产品。1 GB/T 4789.35-2008 5.6 0.5%麦芽糖发酵管:见第A.3章。5.7 0.5%甘露醇发酵管:见第A.3章。5.8 0.5%水杨昔发酵管:见第A.3章。5.9 0.5%山梨醇发酵管:见第A.3章。5.10 0.5%乳糖发酵管:见第A.3章。5. 11 七叶昔发酵管:见第A.4章。5. 12 革兰氏染色液:见第A.5章。6 检验程序乳酸菌检验程序见图10样品25g(或25mL)+225mL灭菌生理盐水7 操作步骤7. 1 样品制备选择2个，_，3个适当稀释度，各以0.1mL加入到MRS琼脂平板和(或)MC琼脂平板进行涂布报告挑取菌落接种于MRS琼脂平板或M
7、C琼脂平板(可选择)图1乳酸菌检验程序图7. 1. 1 样品的全部制备过程均应遵循元菌操作程序。7. 1. 2 冷冻样品可先使其在2oC ,., 5 oC条件下解冻，时间不超过18h，也可在温度不超过450C的条件G/T 4789.35-2008 下解冻，时间不超过15mino 7. 1. 3 固体和半固体食品:以无菌操作称取25g样品，置于装有225mL生理盐水的元菌均质杯内，于8 000 r/mill . -10 000 r/min均质1min,., 2 min，制成1: 10样品匀液;或置于装有225mL生理盐水的元菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min,., 2 min制成1: 10的
8、样品匀液。7. 1. 4 液体样品:液体样品应先将其充分摇匀后以元菌吸管吸取样品25mL放人装有225mL生理盐水的元菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的元菌玻璃珠)中，充分振摇，制成1: 10的样品匀液。7.2 步骤7.2. 1 用1mL元菌吸管或微量移液器吸取1: 10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于装有9mL生理盐水的无菌试管中(注意吸管尖端不要触及稀释液)，振摇试管或换用1支元菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1: 100的样品匀液。7.2.2 另取1mL元菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做10倍递增样品匀液，每递增稀释一次，即换用1次1mL灭菌吸管或吸头。7.2.3 根据待检样品活菌数的
9、估计，选择2个，.，3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取0.1mL稀释液分别置于2个MRS琼脂平板或MC琼脂平板，使用L形棒进行表面涂布。根据样品中所含乳酸菌的种类选择培养基及培养条件，见表1，每一种培养条件的每个稀释度作两个平皿。乳酸菌在MRS和MC培养基上菌落生长形态特征见表2。从样品稀释到平板涂布整个试验过程要求在20min内完成。表1乳酸菌计数培养基及培养条件的选择MRS琼脂平板，36.C土1.C , 48 h MC琼脂平板，36c士1.C , 48 h 样品中所含菌属庆氧兼性庆氧兼性厌氧只含乳杆菌属+ 只含双歧杆菌属+ 同时含乳杆菌属和双歧杆菌属十+ 只含嗜热链球菌+ 同时含乳杆菌属
10、、双歧杆菌属、十嗜热链球菌十十注:十表示使用此培养基及培养条件;一表示不使用此培养基及培养条件。表2乳酸菌在不同培养基上菌落特征菌属MRS琼脂MC琼脂乳杆菌属菌落呈圆形，中等大小，凸起，微白色，湿菌落较小，白色或淡粉色，边缘不太整齐，润，边缘整齐，直径为3mm士1mm，菌落背面可有淡淡的晕，直径2mm:i: l mm，菌落背面(Lactobacillus) 为黄色为粉红色兼性庆氧培养条件下不生长。在庆氧培养兼性厌氧培养条件下不生长。在庆氧培养双歧杆菌属条件下，菌落呈圆形，菌落中等大小，瓷白色，条件下，菌落较小，可有淡淡的晕，白色，边缘l(Bifidobacterium) 边缘整齐光滑，直径为2
11、mm士1mm，菌落背整齐，直径1.5 mm土1mm，菌落背面为粉面为黄色红色嗜热链球菌菌落呈圆形，菌落偏小，白色，湿润，边缘整菌落中等偏小，边缘整齐光滑的红色菌落，(Stre ptococcus 齐，直径为1mm士1mm，菌落背面为黄色可有谈淡的晕，直径2mm士1mm，菌落背面thermohilus) 为粉红色二8 报告根据菌落计数结果出具检测报告。将最终确定的乳酸菌菌落数在30，.，300之间的平板进行计数，GB/T 4789.35-2008 再乘以相应的稀释倍数，采用1川0的指数表示，每克(或毫升)食品中所含有的乳酸菌数以CFU/mL)表示。具体方法按菌落总数的规定报告。9 乳酸菌的鉴定(
12、可选择)9. 1 纯培养挑取3个或以上单个菌落，嗜热链球菌接种于MC琼脂平板，乳杆菌属接种于MRS琼脂平板，置36 oc士1oc兼性厌氧培养48h。9.2 鉴定9.2.1 双歧杆菌的鉴定按GB/T4789.34操作。9.2.2 涂片镜检:乳杆菌属菌体形态多样，呈长杆状、弯曲杆状或短杆状。无芽胞，革兰氏染色阳性。嗜热链球菌菌体呈球形或球杆状，直径为0.5m-.2.0m，成对或成链排列，元芽胞，革兰氏染色阳性。9. 2. 3 API 50CH生化鉴定试剂盒鉴定:选择纯培养平板上的3个独立菌落，分别使用API50CH生化鉴定试剂盒进行生化反应检测，乳酸菌菌种主要生化反应见表3和表4。表3常见乳杆菌属
13、内种的生化反应菌种七叶昔纤维二糖麦芽糖甘露醇水杨昔山梨醇菁、糖干酷乳杆菌干酷亚种(L.casei 十+ + + + + + subsp. casei) 德氏乳杆菌保加利亚亚种(L.del-bruec走iisubsp. bulgaricus) 嗜酸乳杆菌(L.acidophilus) 十+ 十十+ 罗伊氏乳杆菌(L.reuteri) ND 十十鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus) 十十+ 十十+ 十植物乳杆菌(L.plantarum) 十+ 十+ + 十十注:十表示90%以上菌株阳性;一表示90%以上菌株阴性;ND表示未测定。L一一一表4嗜热链球菌的主要生化反应菌种嗜热链球菌(s.thermo
14、hilus) 注:十表示90%以上菌株阳性;一表示90%以上菌株阴性。4 A.1 MRS培养基A. 1. 1 成分蛋白豚牛肉粉酵母粉葡萄糖吐温80磷酸氢二饵(K2HPOt 7H20) 乙酸纳(CH3COONa 3H20) 拧橡酸二镀硫酸续(MgS04 7H20) 硫酸锺(MnS04 4H20) 琼脂粉蒸馆水A. 1.2 制法附录A(规范性附录)培养基及试剂10.0 g 5.0 g 4.0 g 20.0 g 1. 0 mL 2.0 g 5.0 g 2.0 g 0.2 g 0.05 g 15.0 g 1 000 mL GB/T 4789.35-2008 将上述成分加入蒸馆水中，加热溶解，校正pH6
15、.2，分装后121oc高压灭菌15min,._. 20 mino A.2 MC培养基A. 2.1 成分大豆蛋白陈5.0 g 牛肉粉3.0 g 酵母粉3.0 g 葡萄糖20.0 g 乳糖20.0 g 碳酸钙10.0 g 琼脂15.0 g 蒸馆水1 000 mL 1%中性红溶液5.0 mL A.2.2和j法将前面7种成分加入蒸馆水中，加热溶解，校正pH6.0，加入中性红溶液。分装后121oc高压灭菌15 min,._. 20 mino A.3 乳酸杆菌糖发酵管A. 3.1 成分牛肉膏5.0 g 5 GB/T 4789.35-2008 蛋白陈酵母浸膏吐温80琼脂1.6%澳甲盼紫酒精溶液蒸馆水A. 3
16、. 2 制法5.0 g 5.0 g 0.5 mL 1. 5g 1. 4 mL 1 000 mL 按0.5%加入所需糖类，并分装小试管。A.4 七叶昔发酵管A. 4.1 成分蛋白豚磷酸氢二饵七叶昔拘橡酸铁1.6%澳甲盼紫酒精溶液蒸馆水A.4.2 制法5.0 g 1. 0g 3.0 g 0.5 g 1. 4 mL 100 mL 将上述各种成分溶入100mL蒸馆水中，121oc高压灭菌15min、J20mino A.5 草兰氏染色液A.5.1 结晶紫染色液A.5. 1. 1 成分结晶紫95%乙醇1%草酸镀水溶液A.5. 1. 2 制法1. 0g 20 mL 80 mL 将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后
17、与草酸镀溶液混合。A.5.2 革兰氏破液A. 5. 2.1 成分腆腆化饵蒸馆水A. 5. 2.2 制法1. 0g 2.0 g 300 mL 将破与破化饵先进行混合，加人蒸馆水少许充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馆水至300mLo A. 5. 3 沙黄复染液A.5.3.1 成分沙黄95%乙醇蒸馆水A.5.3.2 制法0.25 g 10 mL 90 mL 将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馆水稀释。6 G/T 4789.35-2008 A.5.4 染色法a) 将涂片在酒精灯火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗Fb) 滴加革兰氏棋液，作用1min，水洗;c) 滴加95%乙醇脱色，约15s.-.30
18、 s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗;d) 滴加复染液，复染1mino水洗、待干、镜检。OONlsd号问阁。国华人民共和国家标准食品卫生微生物学检验食品中乳酸菌检验GB/T 4789.35-2008 中骨中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 印张O.75 字数14千字2009年3月第一次印刷开本880X12301/16 2009年3月第一版定价14.元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533* 书号:155066 1-36028 GB/T 4789.35-2008
